COMITETUL DE REDACȚIE Director: Academician MIHAI BĂCESCU Redactor șef: PETRU MIHAI BĂNĂRESCU, membru corespondent al Academiei Române Membri: Academician NICOLAE BOTNARIUC; academician OLGA NECRASOV; prof. dr. GRIGORE STRUNGARU; prof. dr. IRINA TEODORESCU; dr. NICOLAE TOMESCU; prof. dr. RADU MEȘTER - secretar de redacție Revista apare de două ori pe an Pentru a vă asigura colecția completă și primirea la timp a revistei reînnoiți abonamentul dumneavoastră. în țară, revista se poate procura prin poștă, pe bază de abonament la: RODIPET S.A., Piața Presei Libere nr. 1, sect. 1, P.O. Box 33-57, Fax 401- 222 6407, Tel. 401-618 5103; 401-222 4126, București, România. ORION PRESS INTERNATIONAL S.R.L., Șos. Olteniței 35-37, sect. 4, P.O. Box 61-170, Fax 401-312 2425; 401-634 7145, Tel. 401-634 6345, București, România. AMCO PRESS S.R.L., Bd. Nicolae Grigorescu nr. 29A, ap. 66, sect. 3, P.O. Box 57-88, Fax 401-312 5109, Tel. 401-643 9390; 401-312 5109, București, România. Manuscrisele, cărțile, revistele pentru schimb, precum și orice corespondență se vor trimite pe adresa Comitetului de redac- ție al revistei: Institutul de Biologie, Splaiul Independenței nr. 296, București. La revue „Studii și cercetări de biologie animală” paraît deux fois par an. Toute commande de l’etranger pour Ies travaux parus aux Editions de 1’Academie Roumaine sera adressee â: RODIPET S.A., Piața Presei Libere nr. 1, sect. 1, P.O. Box 33-57, Fax 401— 222 6407, Tel. 401-618 5103; 401-222 4126, București, România. ORION PRESS INTERNATIONAL S.R.L., Șos. Olteniței 35-37, sect. 4, P.O. Box 61-170, Fax 401-312 2425; 401-634 7145, Tel. 401-634 6345, București, România. ^OL nay . Studii si cercetări de BIOLOGIE SERIA BIOLOGIE ANIMALĂ TOMUL 49. NR. 2 iulie - decembrie 1997 SUMAR OTILIA ZĂRNESCU, R. MEȘTER, S. LAZÂR, Caracterizarea ultrastructurală a foliculilor ovarieni vitelogenetici la Rana ridibunda ........................... 121 1 • OTILIA ZĂRNESCU. R. MEȘTER, Endocitoză în fază fluidă a FITC-Dextran în ovocitele de Carassius auratus gibelio in vivo și in vitro......................; . . 133 LUCIA MOLDOVAN. MARIA CALOIANU, OTILIA ZĂRNESCU, O ANA CRÂCIU- NESCU, Aspecte ultrastructurale ale corneei la Carassius auratus gibelio.. 139 ț MARIA NĂSTÂSESCU. VIRGINIA POPESCU-MARINESCU, VIORICA MANOLACHE. CARMEN MARINESCU. Acțiunea zincului asupra mantalei, branhiilor și hepatopan- creasului de Anodonta cygnaea (Molusca-Lamellibranchiata)................. 147 ZORICA-ILEANA HERTZOG. M. CRUCE, V. PÎRVULESCU. R. HERTZOG. Instabili- tatea cromozomială constituțională în cancerul de colon .................. 157 ALICE VASILE-ȘERBÂNESCU, AL. G. MARINESCU. D. VIZITIU, Modificarea com- poziției chimice și scăderea în greutate la puietul de crap sub influența perioadei de iernat .................................................................. 165 I. ROȘCA. AL. BĂRBULESCU. Cercetări privind comportamentul în câmp a masculilor de Ostrinia nubilalis Hb. marcați ................................................. 173 ANDREA CRISTINA STAICU. R. MEȘTER. Maturarea ovocitelor la Teleosteeni.................. 179 EDITURA ACADEMIEI ROMÂNE Calea 13 Septembrie, nr. 13, 76117, București telefon 410 38 46/2123, 2107, 2119 St. cerc. biol.. Seria biol. anim., t. 49. nr. 2. p. 119-198, București. 1997 CARACTERIZAREA ULTRASTRUCTURALĂ A FOLICULILOR OVARIENI VITELOGENETICI LA Rana ridibunda OTILIA ZĂRNESCU1, R. MEȘTER1, S. LAZĂR2 The structure of the vitellogenic ovarian follicles in Rana ridibunda is described. The vitello- genic follicle consists of several cellular and acellular layers. The oocyte within follicle is immediately invested by the acellular vitelline envelope, which contains microvillar proces- ses from the oocyte. Overlying the vitelline envelope, a follicular epithelium is comprised of a single layer of steilate follicle cells. In the vitellogenic follicle these cells are periodically interrupted by large intercellular chan- nels. Above the follicle cells is the theca, which contains collagen fibers, blood vessels, and fibroblasts. The ovarian follicle is covered by the inner ovarian epithelium. The apical plasma membrane of these cells displays a macropinocytotic activity. The surface of the vitellogenic oocyte exhibits clathrin-coated pits and “macro” pits which uptake a lamellar material. In the ooplasm throughoutvitellogenesis primordial yolk platelets are in close contact with large yolk platelets. Subsequent fusion of two or more crystallizing platelets gives rise to larger yolk platelets, which contain two or more main bodies. Oocyte of R. ridibunda was found to possess two types of mitochondria which contain crys- talline inclusions. Internalizarea substanțelor nutritive reprezintă un mecanism eficient, prin care se asigură creșterea și diferențierea ovocitelor la vertebratele inferioare. Peste 80% din proteinele ovocitului matur sunt reprezentate de vitelus (3). Acumularea proteinelor viteline are loc în cursul perioadei de vitelogeneză și se realizează printr-o endocitoză mediată de receptor, a unui precursor glicofosfolipoproteic numit vitelogenină (VTG). Acest precursor vitelin este sintetizat în ficat și eliberat ulterior în circulație (33, 37, 38). Observațiile ultrastructurale realizate pe Xenopus laevis și diferite specii de Ranidae, au permis identificarea compartimentelor intracelulare implicate în trans- portul vitelogeninei (1,4, 16,17, 26,40, 41). Aceste studii au demonstrat existența unui material electrono-dens asociat invaginărilor și veziculelor cu înveliș, endo- zomilor, plachetelor viteline primordiale care conțin mase de vitelus condensat și plachetelor viteline mature, formate din proteine cristalizate. în ovocitele amfibienilor au fost descrise două tipuri de vitelus: (a) plachete 122 Otilia Zamescu et al. 2 lin, fosvitin și fosvet (43), înconjurat de un matrix alcătuit din glicoproteine, carbohidrați (7,23) și enzime (30); (b) picături lipidice reprezentate de fosfolipide și lipide neutre (18) ce alcătuiesc „vitelusul lipidic” (40,41). Deși ultrastructura plachetelor viteline a fost examinată la mai multe specii de amfibieni, formarea vitelusului, originea proteinelor viteline, stocarea vitelusu- lui în timpul vitelogenezei (12) și utilizarea lui în embriogeneză (9,24) sunt aspec- te incomplet înțelese. Scopul acestui studiu a fost caracterizarea ultrastructurală a foliculilor ovari- eni vitelogenetici la Rana ridibunda și identificarea organitelor implicate în for- marea vitelusului. MATERIAL ȘL METODĂ Experimentele au fost realizate pe femele de Rana ridibunda neinjectate și injectate cu 20 mg peroxidază (tip II, Sigma) dizolvată în 0,64% NaCl. Femele injectate cu peroxidază au fost sacrificate după 4 ore. Fragmente mici de ovar au fost fixate 3 ore, la 4°C în tampon cacodilat 0,lM (pH-7,4), cu 2% paraformaldehidă și 2,5% glutaraldehidă. După fixare, fragmen- tele de țesut au fost spălate în același tampon cu 7% sucroză, peste noapte la 4°C. Fragmentele de ovar provenite de la femele injectate cu peroxidază au fost incubate 30 minute la întuneric în următoarea soluție: tampon Tris-HCl 0,05M (pH = 7,6), 0,1%, 3,3’ diaminobenzidină (DAB, Sigma) și 0,01% H2O2. După de- veloparea reacției peroxidazice probele au fost spălate în tampon Tris-HCl 0,05M, pH = 7,4, o oră la 4°C, postfixate peste noapte într-o soluție de 2%, OSO4 în tam- pon cacodilat 0,lM (ph-7,4). După spălare cu apă distilată, probele au fost deshi- dratate în etanol și incluse în rășini sintetice (Epon 812). Secțiunile tăiate la ultramicrotom au fost colorate succesiv cu acetat de uranil și citrat de plumb și examinate la microscopul electronic PEM-100. REZULTATE ȘI DISCUȚII Foliculul ovarian vitelogenetic la Rana ridibunda este format dintr-o serie de straturi celulare și acelulare. Stratul extern al foliculului ovarian poartă denumirea de epiteliu ovarian in- tern și este alcătuit din celule aplatizate, unite prin joncțiuni celulare de tipul des- mozomilor. La baza acestui strat există o membrană bazală. în cazul foliculilor vitelogenetici celulele acestui epiteliu prezintă un intens proces de macropinocito- ză la nivelul membranei (fig. 1). De asemenea, în unele celule epiteliale sunt pre- zente în citoplasmă vezicule acoperite cu clatrină (fig. 2). S-a demonstrat că în alte tipuri celulare, macropinocitoza este implicată într-un mecanism neselectiv de intemalizare a macromoleculelor extracelulare (29). Deși 124 Otilia Zămescu et al. 4 macropinocitoza nu a mai fost menționată în celule epiteliale ale foliculului ovari- an, studiile anterioare la Xenopus laevis au evidențiat că membrana acestor celule prezintă un proces activ de pinocitoză, însă veziculele implicate în endocitoză sunt diferite de cele ale ovocitului și nu posedă înveliș (2, 35). între celulele epiteliale de la suprafața foliculilor ovarieni și celulele folicu- lare există teaca foliculară, formată din fibre de colagen, vase de sânge și fibro- blaste (fig. 3). Ocazional, au fost observate celule musculare netede și nervi (6). La Rana ridibunda fibrele de colagen sunt dispuse în direcții diferite și formează două straturi separate de prelungirile citoplasmatice ale fibroblastelor. Studiile de microscopie electronică scanning au indicat la Xenopus.laevis că fibrele din țesutul conjunctiv al tecii formează benzi laxe, orientate neregulat (6). Celulele foliculare formează un monostrat în jurul ovocitului. Ele sunt celule relativ mari, stelate și întrerupte de spații largi (fig. 4). Aceste spații au fost denu- mite canale (4, 35) și permit trecerea moleculelor exogene odată cu începerea vite- logenezei. S-a demonstrat că suprafața bazală a celulelor foliculare suferă modificări considerabile în cursul dezvoltării foliculare (6). Astfel, începând cu stadiul al II-lea al ovogenezei, suprafața dinspre ovocit prezintă macrovili, care pătrund prin anvelopa vitelină pentru a face contact cu microvilii ovocitari. în jurul ovocitului se găsește anvelopa vitelină, care la Rana ridibunda are un aspect lax, fiind formată din filamente de densitate electronică moderată (fig. 4). în regiunea superioară, această anvelopă vitelină prezintă o consistență mai densă. Aspectul electrono-microscopic al anvelopei viteline la Rana ridibunda este dife- rit de cel observat la alte specii de amfibieni. La începutul vitelogenezei, suprafața ovocitului se caracterizează prin prezența unor cripte adânci care delimitează macrovilii, din care se desprind microvili ovocitari lungi și subțiri. în afara numeroaselor invaginări acoperite cu clatrină (fig. 5), la suprafața ovocitului există „macroinvaginări”, care apar a prelua un material exogen lamelar (fig. 6), sau omogen (fig. 7). Acest material apare ulterior în corpii multiveziculari din citoplasmă corticală (fig. 8). Invaginări și vezicule cu înveliș au fost observate și în ovocitele vitelogenetice de la alte specii de amfibi- eni (5,’ 10, 36, 41). Diferențierea ovocitului la vertebratele ovipare are loc datorită acumulării în citoplasmă a unor organite caracteristice, numite plachete viteline. La începutul vitelogenezei în citoplasmă corticală apar numeroși corpi multiveziculari, la care se observă uneori vezicule fuzionate. Corpii multiveziculari sunt heterogeni ca aspect electrono-microscopic, lumenul lor fiind plin fie cu un material filamentos, sau granular necondensat (fig. 9), fie cu agregate mici care indică începutul unui proces de condensare (fig. 10). La Xenopus laevis s-a evidențiat că și ovocitele previtelogenetice în stadiile I și II conțin corpi multiveziculari care sunt grupați la periferia celulei. Deși corpii multiveziculari au fost observați frecvent în stadiile timpurii ale vitelogenezei (12,26,27,40,41), rolul lor în procesarea vitelogeninei și a proteinelor viteline a fost elucidat recent. Wall și Patel (31, 32) au arătat că 7 Ultrastructura foliculilor ovarieni la Rana ridibunda 127 126 Otilia Zărnescu et al. Fig- 9 - Corp multivezicular în lumenul căruia se remarcă un material filamentos; X60000. pjg. 10 - Corp multivezicular la care se remarcă fuziunea cu o veziculă acoperită (săgeata); X60000. acești corpi multiveziculari ovocitari sunt lizozomi modificați, care conțin un nu- măr limitat de hidrolaze lizozomale implicate în decuplarea vitelogeninei de re- ceptorul său (20) și ulterior în clivarea VTG în proteine viteline. Plachetele viteline primordiale au fost identificate în citoplasmă corticală (fig. 11). Aceste structuri prezintă un miez electrono-dens și o matrice înconju- rătoare mai laxă. Ulterior aceste structuri se măresc, corpul central devine cristalin și rămâne înconjurat de o zonă electrono-densă, necristalizată (fig. 12). La perife- ria acestor plachete viteline primordiale se observă corpi multiveziculari fuzionați. A treia categorie de plachete viteline primordiale, observată de noi, este for- mată din organite mai mari alcătuite dintr-un miez cristalin, un matrix înconju- rător mai dens dispus asimetric (nu acoperă întregul cristal vitelin) și o zonă periferică în care se găsesc numeroase vezicule mici (fig. 13). Plachetele viteline primordiale odată formate încep să fuzioneze unele cu altele, în cursul acestui proces miezurile cristaline rămân separate. Această fuziu- ne poate avea loc între plachete viteline primordiale cu aceeași dimensiune (fig. 14), sau cu dimensiuni diferite (fig. 15). Astfel de fuziuni au fost obsevate și la Xeno- pus laevis (21, 31). Plachetele viteline mature prezintă o structură similară cu cea observată de alți autori la diferite specii de amfibieni (8, 9, 14, 22, 24, 33) și se caracterizează prin prezența unui miez cristalin, un strat median mai dens și un strat extern mai lax (fig. 16). Chiar după formarea plachetelor viteline mature, se mai observă fu- ziuni între corpii multiveziculari și stratul extern al plachetei (fig. 17). Injectarea de peroxidază în sacii limfatici a demonstrat că foliculii viteloge- netici preiau trasorul din circulație, acesta fiind identificat ulterior la periferia pla- chetelor viteline primordiale (fig. 18), sau în stratul superficial al plachetelor viteline mature (fig. 19). Prezența peroxidazei la suprafața plachetelor viteline a fost ob- servată de asemenea la Xenopus laevis (5) și ea nu este surprinzătoare, deoarece aceste organite considerate lizozomi modificați reprezintă destinația tuturor mole- culelor intemalizate de ovocit (20). ,în timpul vitelogenezei plachetele viteline primordiale și mature sunt însoțite de picături lipidice cu aspect diferit (fig. 20 a.b.). Un aspect caracteristic speciilor de Ranidae este acela al prezenței cristalelor mitpcondriale. Observațiile noastre au indicat prezența în ovocitele vitelogenetice a două tipuri de mitocondrii care conțin cristale. Primul tip este abundent în mase- le mitocondriale (fig. 21) și cristalul este înconjurat de o membrană dublă, în timp ce mitocondriile înconjurătoare prezintă un matrix dens. Al doilea tip a fost iden- tificat mai ales în citoplasmă corțicală și în jurul cristalului, există structuri mem- branare mai complexe (fig. 22). Observațiile anterioare la Rana esculenta și Rana temporaria (13) au evidențiat că mitocondriile posedă două tipuri de incluzii cristaline, unul localizat în matri- xul mitocondrial și altul în criste (26). Cristalele mitocondriale reprezintă un procent mic din structurile cristaline din o vocitul complet dezvoltat (9) și au fost identificate la diferite specii de Răni- Ultrastructura foliculilor ovarieni la Rana ridibunda 129 128 Otilia Zărnescu et al. Fig. 15 - Fuziuni între plachetele viteline primordiale; X60000. Fig. 16 - Periferia unei plachete viteline mature; a - cristal vitelin; b - strat extern dens; c - strat extern lax; XI80000. Fig- 17 - Corp multivezicular fuzionat cu stratul extern al unei plachete mature; X90000. H Ultrastructura foliculilor ovarieni la Rana ridibunda 131 130 Otilia Zărnescu et al. 10 18 2Oh Fig. 19 - Reacția peroxidazică este pozitivă și în stratul extern al plachetelor viteline mature; XI8000. * vyț Fig. 18 - După injectarea de HRP, reacția peroxidazică apare la periferia plachetelor viteline primordiale; X24000. Fig. 20 a, b - în citoplasmă ovocitului viteloge- netic există picături lipidice (*) cu o morfolo- gie diferită: omogene (a) sau heterogene (b); XI8000. Fig. 21 - Masă mitocondrială în care se remarcă un cristal mitocondrial; X60000. Fig. 22 - Mitocondrie care conține un cristal mitocon- drial; X30000. dae: R.pipiens (11,39,40), R. temporaria și R. esculenta (25), R. catesbeiana (42) și R. nigromaculata (28). 'Deși inițial aceste cristale mitocondriale au fost considerate a sta la originea vitelusului (8,39), ulterior au fost identificate diferențe între cristalele mitocondri- ale și cele viteline (38). Aceste diferențe se referă la structura cristalului (15, 16, 25), compoziția chimică (25, 42) și originea acestor cristale (40, 41). Cu toate că aceste cristale intramitocondriale nu sunt implicate în formarea vitelusului, funcția lor rămâne necunoscută. în concluzie, observațiile noastre realizate pe R. ridibunda au indicat aspecte electrono-microscopice comune cu cele raportate la alte specii de amfibieni, dar și particulare cum ar fi: macropinocitoza celulelor epiteliului folicular, structura an- velopei viteline și prezența unor „macroinvaginări” la nivelul membranei ovocitare. 132 . Otilia Zămescu et al. * 12 BIBLIOGRAFIE 1. BALINSKY B.I., DEVIS R., Acta Embryol. Morphol. Exp., 6: 55-108, 1963. 2. BRUMMETT A.R., DUMONT J.N., J. Ultrastruct. Res., 55: 4-16,1976. 3. CALLEN J.C., TORTE M., DENNEBOU Y.N., MONOLOU LC„ Biol. Cell, 38: 13-18,1980. 4. DUMONT J.N., J. Morphol., 136: 153-180, 1972. 5. DUMONT J.N., J. Exp. Zool., 204: 193-217, 1978. 6. DUMONT J.N., BRUMETT A.R., J. Morphol., 155: 73-98, 1978. 7. FAVARD P„ FAVARD-SERENO C., I. Submicrosc. Cytol., 1: 91-111, 1969. 8. KARASAKIS., J. Cell Biol., 18: 135-151,1963. 9. KARASAKI S., J. Ultrastruct. Res., 9: 225-247,1963. 10. KEMP M.E., STOCKN.L., I. Cell Biol., 34: 111-122, 1967. 11. KESSEL R.G., GANION L.R., J. Submicrosc. Cytol., 12: 647-654, 1980. 12. KRESS A., Experientia (Basel), 38: 761-876,1982. 13. KRESS A., SPORNITZ U.M., Experientia (Basel), 30: 786-788,1974. 14. LANZAVECCHIA G„ Intern. Inst. Embryol. Milano, 61-74, 1961. 15. LANZAVECCHIA G., Atti. Accad. Naz. Lincei., Ser VIII, (8): 1^17, 1961. 16. MASSOVER W.H., J. Cell Biol., 48: 266-279, 1971. 17. MASSOVER W.H., J. Cell Biol., 58: 485-491, 1973. 18. MES-HARTREE M., ARMSTRONG J.B., Can. J. Biochem., 54: 578-582, 1976. 19. OPRESKO L.K., WILEY H.S., WALLACE R.A., Cell, 22: 47-57, 1980. 20. OPRESKO L.K., KARPF R.A., Cell, 51: 557-568, 1987. 21. RICHTER H-P., Roux’s Arch. Dev. Biol., 198: 92-102, 1989. 22. RINGLE D.A., GROSS P.R., Biol. Bull, 122: 263-280, 1962. 23. ROBERTSON N., Cell. Differ., 8: 173-185, 1979. 24. SCRIPCARIU D., MEȘTER R., Rev. Roum. Biol., Biol. Anim., 31: 47-52, 1986. 25. SPORNITZ U.M., Experientia (Basel), 28: 66-67,1972. 26. SPORNITZ U.M., KRESS A., Z. Zellforsch., 117: 235-251, 1971. 27. SPORNITZ U.M., KRESS A., Z. Zellforsch., 143: 387-407, 1973. 28. SUNG H.S., Exp. Cell Res., 25: 702-704, 1961. 29. SWANSON J.A., WATTS C., Trends Cell Biol., 5: 424-428, 1995. 30. WALL D.A., MELEKA L, J. Cell Biol., 101: 1651-1664, 1985. 31. WALL D.A., PATEL S„ Dev. Biol., 119: 275-289, 1987. 32. WALL D.A., PATEL S„ J. Biol. Chem., 262: 14779-14789, 1987. 33. WALLACE R.A., Developmental biology: A comprehensive synthesis (L. Browder, Ed.), Voi. 1: 469-502, Plenum Press (New York), 1984. 34. WALLACE R.A., KARASAKI S., J. Cell Biol., 18: 153-166, 1963. 35. WALLACE R.A., DUMONT J.M., I. Cell Physiol., 72: Supl.l, 1-18, 1968. 36. WALLACE R.A., JARED D.W., J. Cell Biol., 63: 345-351, 1976. 37. WALLACE R.A., OPRESKO L.K., WILEY H.S., SELMAN K„ Molecular biology of egg maturation, CIBA Found. Symp., 98: 228-248, 1983. 38. WALLACE R.A., SEMĂN K., J. Electron. Microsc. Techniq., 16: 175-201, 1990. 39. WARD R.T., J. Cell Biol., 14: 309-341, 1962. 40. WARD R.T., Tissue & Cell, 10: 515-524, 1978. 41. WARD R.T., Tissue & Cell, 10: 525-534, 1978. 42. WARD R.T., OPRESKO L.K., WALLACE R.A., Dev. Biol., 112: 59-65, 1985. 43. WILEY H.S., WALLACE R.A., J. Biol. Chem., 256: 8626-8634, 1981. Primit în redacție la 22 mai 1997. Universitatea București, Facultatea de Biologie, Splaiul Independenței, 91-95. 2lnstitutul Național de Cercetare-Dezvoltare pentru Științe Biologice, București, Splaiul Independenței, 296. ENDOCITOZĂ IN FAZA FLUIDA A FITC-DEXTRAN IN OVOCITELE DE Carassius auratus gibelio „IN VIVO” ȘI „IN VITRO” OTILIA ZĂRNESCU, R. MEȘTER The in vivo and in vitro uptake of a tracer of fluid phase endocytosis (FITC-Dextran; Av. Mol. Wt-580,000 D) into developing oocytes of Crucian carp, Carassius auratus gibelio, was studied. For in vivo study we have injected FITC-Dextran to young growing females and sampled after 24 hours. Also, the development of a short-term culture system (1, 3, 4 and 24 hours) meant for studying FITC-Dextran sequestration in vitro into previtellogenic and early vitello- genic follicles of Crucian carp is described. In vivo, the size of follicles had a considerable bearing on the rate of exogenous substance sequestration; previtellogenic follicles did not uptake FITC-Dextran in considerable amounts. These results indicate that the ability of oocytes to sequester exogenous molecules with a high molecular weight depends in vivo on opening of intercellular channels through the follicular tissues, thus allowing blood-bome compounds to reach the oocyte surface. In vitro sequestration of FITC-Dextran persisted at temperatures below 4°C, showing that the uptake mechanisms were adapted to low temperatures in this species. Also, in vitro studies showed that late previtellogenic follicles divested of the surface epithelium and follicles di- vested of both the surface epithelium and theca (and sometimes of follicle cells) were capable of sequestering fluorescent tracer at a higher rate. La vertebratele inferioare, creșterea și diferențierea ovocitului implică prelu- area prin endocitoză mediată de receptor a unei proteine plasmatice sintetizată în ficat numită vitelogenină (21, 39). O dată intemalizată, vitelogenină este clivată proteolitic și convertită în proteine viteline de tipul lipovitelinului și fosvitinului, molecule care sunt depozitate în granule (pești) sau plachete viteline (amfibieni). Studierea căii prin care diferite molecule ajung la ovocit s-a realizat folosind markeri electrono-denși ca peroxidază (1, 2, 8, 16, 23, 24, 42), feritină (6, 8), dextran-fier, thorotrast (8) și vitelogenină marcată radioactiv (23, 24, 38), sau cu aur coloidal (41). Berlin și Oliver (4) au caracterizat FITC-Dextranul ca un indicator al endoci- tozei în fază fluidă, observându-se ulterior că acest trasor nu traversează membra- na plasmatică și nu se adsoarbe la suprafața celulelor (33). Dextranii fluorescenți sunt relativ inerți și prezintă toxicitate redusă, fiind folosiți pentru studierea comu- nicării dintre celule și monitorizarea preluării și procesării moleculelor exogene în cadrul procesului de endocitoză (13). St. cerc, biol., Seria biol, anim., t. 49, nr. 2, p. 133-138, București, 1997 134 Otilia Zărnescu et al. 2 3 Endocitoza FITC-dextran în ovocite 135 Elaborarea unor sisteme de cultură pe termen lung pentru foliculii ovarieni în dezvoltare este, în general, dificilă (11, 20, 22). în cazul vertebratelor ovipare, numai la amfibieni (Xenopus laevis) s-a realizat supraviețuirea și creșterea ovoci- tului pe parcursul a câteva zile (36, 37, 38). La peștii teleosteeni au fost raportate o serie de culturi pe termen scurt (până la 24 de ore) în care ovocitul și-a menținut viabilitatea și a sechestrat vitelogenina din mediu (14, 17, 19, 25, 26, 30). S-a demonstrat că în ovarul mamiferelor comunicarea intercelulară este esențială pentru funcția ovocitară normală. Deși rolul acestei comunicări interce- lulare în ovarul peștilor nu este complet elucidat, el poate juca un rol important. în general, procedurile manuale de îndepărtare a straturilor periovocitare pot de- termina leziuni mecanice care afectează supraviețuirea și creșterea ulterioară a ovocitului. S-a demonstrat recent la Oncorhynchus mykiss (19) că foliculii ovarieni cultivați până la 6 zile, individual sau sub formă de lamelă (grup de 10 foliculi ovarieni) supraviețuiesc și sechestrează vitelogenina din mediu, pe care o proce- sează ulterior prin clivaj proteolitic. Scopul acestui studiu a fost caracterizarea preluării în fază fluidă a unui tra- sor fluorescent (FITC-Dextran) in vivo și in vitro în foliculii previtelogenetici și vitelogenetici timpurii de Carassius auratus gibelio. MATERIAL ȘI METODĂ Experimentele.au fost realizate pe femele de Carassius auratus gibelio, pro- venite de la Stațiunea de Cercetări Piscicole Nucet. Administrarea conjugatului FITC-Dextran in vivo: Femele de caras în greutate de 85-90g au fost injectate intraperitoneal cu 1 ml de FITC-Dextran (Sigma, SUA), cu o greutate moleculară de 580,000 D, dizolvat în 0,8% NaCl. Concentrația administrată a fost de 70 mg/ml. Animalele au fost sacrificate după 24 de ore. Administrarea conjugatului FITC-Dextran in vitro: S-au recoltat fragmente de ovar care au fost plasate în mediu de cultură Lei- bovitz (L-15, Sigma, SUA), pH 7,7, filtrat prin filtru steril de 0,22 pm (Sartorius AG, Germania). Foliculii ovarieni izolați din fragmentele ovariene au fost incubați o oră la tem- peratura camerei în mediul de cultură L-15, suplimentat cu 10% ser fetal de vițel (Gibco, SUA) și antibiotice (streptomicină 250 pg/ml și penicilină G 250 u.i/ml). După acest interval de timp, s-au îndepărtat din mediu ovocitele alterate. Restul foliculilor ovarieni au fost incubați în mediul de cultură în prezența FITC-Dextran, într-o concentrație de 2,5 mg/ml. S-au cultivat câte 30 de ovocite în plăcuțe sterile de 1 ml. t. Incubarea ovocitelor s-a realizat inițial două ore la 4°C, după care au fost aduse la temperatura camerei, unde s-a continuat incubarea la diferite intervale de timp: 1, 3,4, și 24 de ore. La sfârșitul perioadelor de incubare, foliculii ovarieni au fost spălați de trei ori cu mediu de cultură L-15, la care s-a adăugat 0,1% albumină serică bovină. Prelucrarea probelor pentru vizualizarea în microscopia de fluorescenta Fragmente de ovar de la femele de caras injectate intraperitoneal și foliculii ovarieni cultivați în prezența FITC-Dextran au fost fixate peste, noapte la 4°C în 10% formaldehidă, în tampon fosfat salin, pH 7,4. La fixator s-a adăugat 1%DMSO. După fixare probele au fost spălate, deshidratate, clarificate și incluse în pa- rafină cu punct de topire 42-44°C (Merck, Germania). Lamele cu secțiuni au fost montate în glicerol: PBS (9.T) cu 2 mg/ml pheny- lendiamină și au fost examinate la un microscop Fluoval (Zeiss, Jena), echipat cu lampă de mercur în sistem epifluorescent și filtre corespunzătoare pentru FITC. După vizionarea în microscopia de fluorescență, lamele au fost colorate cu hematoxilină-eozină. REZULTATE ȘI DISCUȚII Ovarul femelelor de Carassius auratus gibelio folosit în experimentele de endocitoză in vivo și in vitro se caracterizează prin prezența foliculilor ovarieni previtelogenetici și vitelogenetici timpurii. Endocitoza complexului FITC-Dextran in vivo La 24 de ore după administrarea trasorului se observă o acumulare intensă în interiorul vaselor de sânge din teaca foliculară (fig. IA) și în celulele foliculare din jurul ovocitelor previtelogenetice timpurii (fig. 1B) si târzii, cu alveole corticale (fig. IC). în citoplasmă periferică a ovocitelor vitelogenetice timpurii, ligandul a fost intemalizat în cantități reduse, fiind localizat în lizozomii corticali (fig. 1D). Cea mai intensă acumulare a fost observată în această variantă experimentală, în in- teriorul foliculilor atretici (fig. IE). ' Studierea in vivo a căii prin care diferite molecule ajung la ovocit s-a realizat folosind markeri electrono-denși ca peroxidază (1, 2, 9, 16, 23, 24, 42), feritină (6, 9), dextran-fier, thorotrast (9) și vitelogenină marcată radioactiv (23, 24, 39), sau cu aur coloidal (41). S-a arătat anterior la Carassius auratus gibelio (42) că moleculele exogene trebuie să străbată în drumul lor spre ovocit o serie de straturi celulare și acelulare. Moleculele exogene pot fi preluate de către celulele endoteliale ale capilarelor tecale și pot fi identificate în lizozomii celulelor tecale și foliculare din foliculii previtelogenetici și vitelogenetici timpurii. 136 OtiliaZamescu et al. 4 Transportul moleculelor prin epiteliul folicular se realizează în principal prin canale existente între celule (23, 24, 41). Prezența acestor canale a fost demon- strată la diferite specii de pești (10, 12, 18). Capacitatea foliculilor ovarieni de a sechestra VTG este corelată cu deschiderea canalelor din țesutul folicular, ceea ce permite proteinelor serice să ajungă la suprafața ovocitului (31, 34, 40). Intemalizarea redusă a ligandului în ovocitele previtelogenetice poate fi ex- plicată prin faptul că aceste canale nu sunt încă operaționale pentru a lăsa să treacă molecule de dimensiunea FITC-Dextranului (580 000 D). Greutatea moleculară a vitelogeninei native la Carassius auratus, principala proteină serică intemalizată de ovocit este de 380 000 D(8). Endocitoză complexului FITC-Dextran in vitro în figura 2A se remarcă foliculii ovarieni previtelogenetici târzii și viteloge- netici timpurii, precum și lamele ce conțin foliculi previtelogenetici timpurii. Ana- lizele histologice au arătat că majoritatea foliculilor supraviețuiesc bine în cultură și intemalizează moleculele exogene. S-a demonstrat anterior că în cazul peștilor din zonele temperate, mediul de cultură L-15 suplimentat cu ser fetal de vițel și antibiotice reprezintă un mediu adecvat pentru culturile celulare și tisulare (7). Foliculii ovarieni sunt înconjurați fie de celulele foliculare (fig. 2B), fie celu- lele foliculare s-au desprins sub formă de teci, astfel încât ovocitul rămâne încon- jurat numai de’ zona radiata (fig. 2C). Foliculii neviabili se caracterizează prin coalescența citoplasmei și formarea unei zone translucide la periferia ovocitului (fig. 2D). Pierderea viabilității ovoci- tuldi reprezintă probabil o alterare a funcției osmotice normale (19). La Onchorhyncus mykiss (30) îndepărtarea epiteliului și tecii foliculare de- termină o supraviețuire de 50-55% a ovocitelor, în timp ce completa denudare a foliculului (îndepărtarea epiteliului, tecii și celulelor foliculare), determină o supraviețuire de sub 40% (26). S-a demonstrat recent că în cazul cultivării ovoci- telor în grup (lamele ovariene cu 10 foliculi), supraviețuirea este mult îmbunătățită (90%, după 6 zile de cultură). Experimentele noastre au arătat că foliculii previtelogenetici și vitelogene- tici timpurii sechestrează FITC-Dextran din mediul de cultură. După incubare, 2 ore la 4°C ligandul fluorescent a fost detectat la nivelul porilor zonei radiata (fig. 3A) și în citoplasmă corticală a ovocitelor vitelogenetice timpurii (fig. 3B), ceea ce sugerează că procesul de internalizare nu este dependent de temperatură. La 3 ore de incubare la temperatura camerei, ligandul fluorescent a fost iden- tificat în lizozomii corticali din ovocitele vitelogenetice timpurii (fig. 3C), pentru ca ulterior, la 4 ore să existe o acumulare intensă în unii foliculi previtelogenetici târzii cu alveole corticale (fig. 3D). După 24 de ore de cultură, se remarcă în toată citoplasmă ovocitelor vitelo- geneticetimpurii numeroși corpi multiveziculari care conțin ligandul fluorescent Fig. 4 A-D - Endocitoză complexului FITC-Dextran in vitro. A - după 24 de ore de cultură apar numeroși corpi multiveziculari fluorescenți în citoplasmă ovocitelor vitelogenetice; B - o acumulare mai intensă a FITC-Dextran în citoplasmă corticală a ovocitelor previtelogenetice timpurii și târzii cu alveole corticale - C; D - în cazul în care celulele foliculare și tecale rămân în jurul ovocitului, ele intemalizează masiv FITC-Dextran (săgeata) blocând accesul acestuia la ovocit. Fig. 3 A-D - Endocitoză complexului FITC-Dextran in vitro. A - după incubare 2 ore la 4°C ligandul fluorescent a fost detectat la nivelul porilor zonei radiata și în citoplasmă corticală a ovocitelor vitelogenetice timpurii - B. Fig. 1 A-E - Endocitoză complexului FITC-Dextran in vivo. A - acumulare intensă în interi- orul vaselor de sânge din teaca foliculară (săgeata); B - internalizarea complexului fluorescent de către celulele foliculare din jurul ovocitelor previtelogenetice timpurii (săgeata); C - prelua- rea complexului fluorescent de către celulele foliculare din jurul ovocitelor previtelogenetice târzii cu alveole corticale (săgeata); D - FITC-Dextranul se acumulează foarte intens în foliculii ovarieni atretici; ac - alveole corticale; E - cea mai puternică acumulaie de FITC-Dextran a fost observată în foliculii atretici. 5 Endocitoza FITC-dextran în ovocite 137 Fig. 2 A-D - Morfologia foliculilor ovarieni viabili (A-C) și neviabili (D) în cultură. A - foliculi ovarieni previtelogenetici târzii (săgeata), vitelogenetici timpurii (—») și lamele ovariene care conțin foliculi previtelogenetici timpurii (*); B - în cultură foliculii vitelogenetici pot fi înconjurați de stratul celulelor foliculare (săgeata); C - acest strat se desprinde de pe suprafața ovocitului (săgeata); ac - alveole corticale; zr - zona radiata; D - alterarea ovocitului este însoțită de apariția unei zone translucide la periferie (săgeata). (fig. 4A). De asemenea, se constată o acumulare intensă în citoplasmă corticală a ovocitelor previtelogenetice timpurii (fig. 4B) și târzii, cu alveole corticale (fig. 4C). In vitro, în cazul în care celulele foliculare și tecale rămân în jurul ovocitului, ele intemalizează masiv FITC-Dextran, blocând accesul acestuia la ovocit (fig. 4D). O serie de studii au demonstrat că ovocitele pot prelua diferite molecule exo- gene, dacă sunt prezente în concentrații corespunzătoare în spațiul periovocitar sau, în mediul de incubare (3). La șoarece s-a demonstrat recent (15) că zona pellucida este permeabilă pen- tru FITC-Dextrani cu greutăți moleculare cuprinse între 71,2 kDa și 170 kDa. Rezultatele noastre demonstrează o acumulare mai intensă a FITC-Dextranului în cazul foliculilor ovarieni în cultură. Aceste rezultate sunt probabil consecința îndepărtării învelișurilor periovocitare în cazul foliculilor cultivați, astfel încât li- gandul poate ajunge la suprafața ovocitului și este ulterior intemalizat. în acest sens, s-a demonstrat că la Xenopus laevis pinocitoza in vitro în foli- culii ovarieni fără teacă este mai intensă decât cea in vivo (35, 36). în ovocitele previtelogenetice liganzii intemalizați nespecific sunt destinați lizozomilor. S-a demonstrat că la pești primii lizozomi apar în stadiile timpurii ale ovoge- nezei, și se găsesc izolați, sau în grupuri în citoplasmă corticală (6, 27, 32). Ulteri- or, ei se acumulează rapid, inițial formând un strat cortical continuu, pentru ca apoi să migreze în toată citoplasmă. Din acest moment ei formează cel mai volu- minos compartiment al celulei chiar după formarea alveolelor corticale. La înce- putul vitelogenezei lizozomii pierd activitatea hidrolazică. Datorită acestui comportament enzimatic diferit al lizozomilor ovocitari, moleculele exogene intemalizate de ovocitele previtelogenetice sunt supuse de- gradării în timp ce o parte din cele care pătrund în ovocitele vitelogenetice se pot integra în plachetele viteline în formare. în acest sens, s-a demonstrat că ovocitele peștilor sunt capabile să intemalizeze nespecific diferite molecule (feritină, HRP, BSA) prin endocitoză în fază fluidă, care sunt transportate ulterior la plachetele viteline (5, 6, 24, 28, 29, 42). în concluzie, rezultatele noastre demonstrează că moleculele exogene cu gre- utate moleculară de 580,000 D nu pot fi intemalizate eficient in vivo, în foliculii previtelogenetici și vitelogenetici timpurii, datorită faptului că între celulele foli- culare canalele intercelulare nu au devenit permeabile pentru molecule de această dimensiune. în cultură, reducerea sau absența învelișurilor foliculare permite accesul li- gandului fluorescent la ovocit. BIBLIOGRAFIE 1. ABRAHAM M„ HILGE V., LISON S„ TIBIKA H., Isr. J. Zool., 30: 110,1981. 2. ABRAHAM M., HILGE V., LISON S., TIBIKA H., Cell Tissue Res., 235: 403-410, 1984. 3. AIZENSHTADT T.B., Oocyte growth and maturation (T.A. Detlaff, S.G. Vassetzky, Eds), Ple- num Publ. Co. (New York), 1-75,1988. 138 Otilia Zărnescu et al. 6 4. BERLIN R.D., OLIVER J.M., J. Cell Biol., 85: 660-671, 1980. 5. BRUMMETT A.R., DUMONT J.M., J. Ultrastruct. Res., 55: 4-16, 1976. 6. BUSSON-MABILOT S„ Biol. Cell, 51: 53-66, 1984. 7. CHEN S.N., KOU G.H., Invertebrate and fish tissue culture (Y. Kuroda, E. Kurstak, K. Mara- morosch, Eds), Japan Sci. Soc. Press (Tokyo), 218-227, 1988. 8. DE VAMING V.L., WILEY H.S., DELAHUNTY G„ WALLACE R.A., Comp. Biochem. Phy- siol., 67B: 613-623, 1980. 9. DUMONT J.N., J. Exp. Zool., 204: 193-217, 1978. 10. DUMONT J.N., BRUMMETT A.R., J. Morphol., 155: 73-98, 1978. 11. EPPIG J.J., Arch. Pathol. Lab. Med., 379-382, 1992. 12. GURAYAS.S., The cell and molecular biology offish oogenesis, Karger (Basel), 86-102, 1986. 13. HAUGHLAND R.P., Handbook of fluorescent probes and research Chemicals, Molecular Probe Inc., 400-411, 1996. 14. KANUNGO J., PETRINO T.R., WALLACE R.A., J. Exp. Zool., 254: 313-321, 1990. 15. LEGEE M„ J. Exp. Zool., 271: 145-150, 1995. 16. Le MENN F., Proc. Int. Symp. Reproductive Physiology of Fish, Wageningen, 198, 1982. 17. MATSUBARA T„ ADACHI S„ IJIRI S„ YAMAUCHI K„ Fischeries Science, 61: 478-481,1995. 18. NAGAHAMA Y., CHAN K„ HOAR W.S., Can. J. Zool., 54: 1128-1139, 1976. 19. NAGLER J.J., TYLER C.C., SUMPTER J.P., J. Exp. Zool., 269: 45-52, 1994. 20. NUTTINCK F„ Theriogenology, 39: 811-821, 1993. 21. OPRESKO L.K., WILLEY H.S., WALLACE R.A., Cell, 22: 47-57, 1980. 22. ROY S.K., GREENWALD G.S., I. Reprod. Fertil., 87: 103-114, 1989. 23. SELMAN K„ WALLACE R.A., Tissue & Cell, 14: 555-571, 1982. 24. SELMAN K„ WALLACE R.A., J. Exp. Zool., 226: 441-457, 1983. 25. SELMAN K„ WALLACE R.A., SARKA A., QI X., J. Morphol., 218: 203-224, 1993. 26. SHIBATAN., YOSHIKUMYM., NAGAHAMA Y.,Develop.GrowthDiffer„ 35:115-121,' 1993. 27. SIRE M.F., BABIN P.Y., VERNIER J.M., J. Exp. Zool., 269: 69-83, 1994. 28. TYLER C.R., SUMPTER J.P., BROMAGE M.R., J. Exp. Zool., 246: 171-179, 1988. 29. TYLER C.R., SUMPTER J.P., BROMAGE M.R., J. Exp. Zool., 248: 199-206, 1988. 30. TYLER C.R., SUMPTER J.P., BROMAGE M.R., J. Exp. Zool., 255: 216-231, 1990. 31. TYLER C.R., SUMPTER J.P., Fish Fisheries Rev., 246: 171-179, 1996. 32. VARO M.I., MEȘTER R., SCRIPCARIU D„ PECINGINE L„ Rev. Roum. Biol. Anim., 22: 27-32. 1977 33. VAN DEURS B„ ROPKE C., THORBALL N.,.Eur. J. Cell. Biol., 34: 96-102, 1984. 34. WALLACE R.A., Developmental biology (1. Browder, Ed.), 1: Plenum Press (New York), 1985. 35. WĂLLACE R.A., JARED D.W., DUMONT J.N., SEGA M.W., J. Exp. Zool., 184: 321-334, 1973. 36. WALLACE R.A., MISULOVIN A.Z., JARED D.W., WILEY S., Gamete Res., 1: 269-280, 1978. 37. WALLACE R.A., DEUFEL R.A., MISULOVIN J., Comp. Biochem. Physiol., 65B: 151-155, 1980. 38. WALLACE R.A., SELMAN K., Am. Zool., 21: 325-343, 1981. 39. WALLACE R.A., OPRESKO L„ WILLWEY H.S., SELMAN K., Molecular biology of cgg maturation, CIBA Found. Symp., 98, Pitman Books (London), 228-248, 1983. 40. WALLACE R.A., SELMAN K„ Dev. Biol., 110: 492-498, 1985. 41. YOSHIZAHI N„ Develop. Growth Differ., 34; 517-527, 1992. 42. ZĂRNESCU O., MEȘTER R„ St. Cerc. Biol. Biol. Anim., 49: 13-26, 1997. Primit în redacție Universitatea București, la 15 mai 1997. - Facultatea de Biologie, Spl. Independenței, 91-95. ASPECTE ULTRASTRUCTURALE ALE CORNEEI LA Carassius auratus gibelio LUCIA MOLDOVAN*, MARIA CALOIANU*, OTILIA ZĂRNESCU**, OANA CRĂCIUNESCU* The comea of the Crucian carp, Carassius auratus gibelio, was examined at the transmission electron microscopic level. The presence of glycosaminoglycans (GAG) in this fish comea was revealed by a specific method using Ruthenium Red as a cationic dye. The layers found in the Crucian carp comea were: the epithelium, the stroma, a thin and partially broken endothelial basement membrane (instead of the Descemet’s membrane), the endothelium. No true Bowman’s layer was observed. Posterior to the stroma we identified a thick cellular layer that represented the autochthonous layer. The comeal stroma contains numerous collagen fibrils lamellas, orientated perpendicularly to neighbouring lamellas and a few scattered keratocytes. Electron micrographs of Ruthenium Red stained corneal stroma show GAG filaments bridging collagen fibrils, in a pattern similar to that observed in bovine comeal stroma. Corneea este un țesut transparent, avascular și foarte inervat, situat la polul anterior al globului ocular. Este formată din celule și o matrice extracelulară (MEC) abundentă, constituită în principal din colageni și proteoglicani. Celulele corneei sunt reprezentate de keratocite, celule epiteliale și endoteliale (1,2). Pe lângă proprietățile sale optice, fiind cea mai importantă lentilă de refracție a ochiului, corneea are și rol de protecție, formând o barieră rezistentă mecanic și impermeabilă chimic între ochi și mediul înconjurător. Principala proprietate a corneei rămâne transparența, care a fost mult studiată atât la vertebratele superi- oare, cât și la cele inferioare și s-a dovedit a fi rezultatul absorbției minime a luminii de către stroma corneană, ceea ce determină o atenuare a intensității lumi- noase (3, 4, 5). Numeroase studii au arătat că proprietățile optice și mecanice ale corneei sunt determinate atât de structura și compoziția sa unică cât și de caracte- risticile țesuturilor adiacente, cum sunt glandele conjunctivale și lacrimale, care mențin o suprafață corneană anterioară netedă (6, 7, 8). Din punct de vedere structural, cel mai mult s-a studiat corneea vertebratelor superioare, care prezintă o structură unică, relativ simplă, cuprinzând din direcția anterior-posterioară cinci straturi principale: epiteliul, stratul Bowman, stroma, membrana Descemet și endoteliul. Studii relativ recente asupra corneei unor ver- tebrate inferioare acvatice ca de exemplu, teleosteenii, au evidențiat și alte compo- st. cerc, biol., Seria biol, anim., t. 49, nr. 2, p. 139-146, București, 1997 141 140 Lucia Moldovan et al. 2 nente structurale, ca o adaptare la mediul de viața, cum ar fi lentilele sau membranele de protecție, stratul autohton, stratul iridiscent și filtrul comean galben (9,10,11). Scopul prezentei lucrări a fost caracterizarea electronomicroscopică a cor- neei de Carassius auratus gibelio și evidențierea glicozaminoglicanilor din stro- ma sa comeană printr-o metodă de microscopie electronică specifică, utilizând drept colorant roșu de ruteniu. MATERIAL ȘI METODĂ Comeile de caras auriu au fost procurate de la Stațiunea de Cercetări Piscico- le Nucet. Țesuturile prelevate imediat după șacrificarea peștilor au fost fixate timp de 6 zile în tampon cacodilat de sodiu O,1M, pH 7,4 conținând glutaraldehidă 2,5% și paraformaldehidă 2%. Fragmentele de comei astfel fixate au fost postfixate în tampon cacodilat O,1M, conținând tetraoxid de osmiu 1%, pentru 2h, la 4°C. După deshidratare și includere în Epon 812, .secțiunile ultrafine au fost colorate cu acetat de uranil și citrat de plumb, în vederea analizării prin microscopie electronică (uti- lizând un microscop PEM-100). Pentru evidențierea glicozaminoglicanilor (GAG) în corneea de pește, com- parativ cu cea bovină am utilizat o metodă modificată de colorare specifică cu roșu de ruteniu (Ruthenium Red-Merck) (12). Fragmente din cele două țesuturi au fost fixate în tampon cacodilat de sodiu O,1M, pH 7,4 conținând glutaraldehidă 2,5% și roșu de ruteniu 0,3%. După spălarea de trei ori, câte 15 minute, cu soluție de ca- codilat de sodiu 0,1 M, pH 7,4, probele au fost postfixate în tampon cacodilat de sodiu O,1M, pH 7,4 conținând tetraoxid de osmiu 1% și roșu de ruteniu 0,3%. Etapele ulterioare sunt comune cu cele prezentate la metoda de mai sus. REZULTATE Pentru studiul organizării structurale a corneei de caras auriu (Carassius au- ratus gibelio), am utilizat microscopia electronică de transmisie. Imaginile obținute au evidențiat că, la suprafața corneei, există un epiteliu pluristratificat, care se continuă cu epiteliul conjunctivei. Celulele epiteliale su- perficiale prezintă în microscopia electronică numeroase spații intercelulare și interdigitații (fig. 1). Toate celulele epiteliale sunt unite prin joncțiuni celulare de tipul desmozomilor (fig. 2). Sub epiteliu există o membrană bazală redusă ca di- mensiune. Stroma comeană este alcătuită din numeroase lamele, în care fibrele de cola- gen ale fiecărui strat sunt strâns împachetate într-o substanță fundamentală, amorfa (fig. 3). Fibrilele de colagen din fiecare lamelă sunt orientate în unghi drept față de cele din lamelele adiacente (fig. 4). 1 - Celulă epitelială în corneea de caras auriu. Se remarcă prezența spațiilor intercelulare și a interdigitațiilor (săgeți); X6800. pig* 2 " Celuleie epiteliale sunt unite prin joncțiuni celulare de tipul desmozomilor (săgeată); X34000. pig 3 - Dispoziția lamelelor de colagen din stroma corneei de pește. Fiecare lamelă este compusă din fibrile subțiri de colagen paralele între ele; X13600. Fig- " Diblele de colagen dintr-o lamelă sunt orientate perpendicular față de cele din lamelele vecine; X34000. 142 143 Fig. 5 - In regiunea posterioară a stromei sunt prezente lamele colagenice mai subțiri comparativ cu restul stromei; XI7000. Fig. 6 - Keratocit dispus între lamelele stromale; X10200. Fig. 7 - Prelungire citoplasmatică a keratocitului stromal; XI7000. Fig. 8 - Membrană bazală endotelială incompletă (săgeată); X34000. Fig. 9 - Stratul autohton format din celule mari, vacuolizate; X50000. Fig. 10 - Imagine de microsco- pie electronică a glicozamino- glicanilor asociați cu fibrilele de colagen în stroma corneei de caras auriu (săgeți); X34000. Fig. 11 - Evidențierea electro- nomicroscopică a glicozamino- glicanilor îri stroma corneei de bovine (săgeți); X50000. 144 Lucia Moldovan et al. 6 ' 7 Ultrastructura corneei la caras 145 în regiunea posterioare, în apropierea endoteliului, lamelele stromale sunt mai subțiri (fig. 5), comparativ cu restul stromei. între lamelele stromale se găsesc keratinocite (fig. 6), care prezintă prelungiri citoplasmatice lungi (fig. 7). în cito- plasmă acestor celule, se găsesc distribuite perinuclear mitocondrii, picături lipi- dice și glicogen. La această specie nu s-a putut observa o membrană Descemet deși, uneori, se remarcă, în anumite regiuni, o membrană bazală endotelială incompletă (fig. 8). Sub această membrană s-a evidențiat un strat endotelial foarte subțire. în cazul corneei de pește, în regiunea posterioară a stromei corneene se găsește un strat autohton, alcătuit dintr-un țesut lax, format din celule mari, vacuolizate (fig. 9). Colorarea cu roșu de ruteniu a evidențiat în microscopia electronică prezența GAG care decorează fibrilele de colagen din stroma corneană (fig. 10). Modelul de decorare a fibrilelor de colagen cu GAG este similar cu cel observat de noi în cazul fibrilelor de colagen din stroma corneană bovină (fig. 11). DISCUȚII învelișul extern al globului ocular este reprezentat în partea sa anterioară de o membrană transparentă numită comee, care se continuă la nivelul limbului sclero-cornean cu o structură, alb-gălbuie, sclerotica. Lumina care ajunge la nivelul corneei este reflectată și refractată, corneea având rolul unei lentile convergente, a cărei putere este determinată de indicele de refracție, care la mamifere are valoarea medie de 1,37 (13). La vertebratele inferi- oare acvatice, indicele de refracție al luminii este foarte mic în raport cu cel găsit la mamifere. De aceea, rolul principal al corneei acvatice este realizarea.unei protecții între ochi și apă și menținerea unei suprafețe optice, transparentă și netedă (14). Pentru studiul structurii corneei de Carassius auratus gibelio și al organi- zării macromoleculelor sale structurale (colagen și glicozaminoglicani) am folosit microscopia electronică de transmisie. După cunoștințele noastre, acestea sunt pri- mele observații asupra corneei de caras auriu. Suprafața celulelor epiteliale externe ale corneei de caras auriu prezintă nu- meroase evaginări sub formă de microvili și micropliuri, într-un aranjament simi- lar cu cel observat în corneea altor teleosteeni ca, de exemplu, Limnichthyes fasciatus (14) și Lepisosteus platyrhincus (15). Studii anterioare au arătat că aran- jamentul acestor spații intercelulare este specific speciei și că, rolul lor important este de a mări suprafața de difuzie și transport activ al sărurilor între ochi și apa din jur. La om și mamifere, cu excepția celor marine, microcutele epiteliale joacă un rol major în stabilizarea lichidului lacrimal esențial pentru vederea clară (16). în corneea de Carassius auratus gibelio s-a evidențiat prezența unei mem- brane bazale epiteliale fine, dar nu s-a observat un strat Bowman bine definit. în condițiile în care stratul Bowman lipsește, se pare că membrana bazală, alături de epiteliul pluristratificat au rolul unei bariere pentru fluxul de ioni de sodiu și apă (17). Acest strat nu s-a evidențiat nici la alți teleosteeni, precum Limnichthyes fasciatus (14), dar a fost observat la Petromyzon marinus (18) și la unele elasmo- branhii (19). Următorul strat comean evidențiat a fost stroma, care este alcătuită din fibri- le de colagen, asociate în lamele orientate perpendicular una față de alta, într-o formă similară cu cea de la comeile vertebratelor superioare. Grosimea lamelelor colagenice este diferită în regiunea posterioară, comparativ cu cea anterioară. Existența lamelelor de colagen mai groase în regiunea de lângă epiteliu poate fi rezultatul lipsei stratului Bowman. Dispoziția fibrilelor de colagen în stroma cor- neei de caras auriu și cea a keratocitelor este similară cu cea observată la bovine în studiile noastre anterioare (5). în regiunea posterioară a corneei de caras auriu, între stromă și endoteliu, a fost pus în evidență un strat de țesut conjunctiv cu celule mari, denumit stratul autohton. Acest strat a fost inițial sesizat de către Munk (1968) la Lepisosteus productus și Amia (20). Deși originea și dezvoltarea acestui strat nu sunt pe deplin elucidate, se crede că funcția sa de bază este una de refracție (11). La comeile unor teleosteeni (Corythoichthyes paxtonî), acest strat se unește posterior cu un strat celular iridiscent. Culoarea celulelor iridiscente depinde de grosimea și indicele de refracție al stratului respectiv și de unghiul de incidență al luminii (11). La L. fasciatus, între stratul autohton și cel iridiscent, s-a evidențiat prezența unor filtre colorate, specifice pentru condițiile diurne, precum filtrul comean galben (14). Peștii bentonici, care se scufundă în nisip, și-au dezvoltat și alte structuri specializate, cum sunt membranele de protecție denumite și lentile (14). Membrana Descemet apare, la peștele studiat, ca o membrană endotelială întreruptă, asemănător cu cea evidențiată de Collin & Collin la L. platyrhincus (15). Studii anterioare au raportat că, la pești, membrana Descemet este foarte subțire, sau chiar lipsește la unele specii precum Petromyzon marinus (18), sau Triglia cuculus (21). La peștii la care acest strat lipsește s-a evidențiat în stroma corneană prezența unor fibre de sutură între fibrilele de colagen uniform organi- zate, care pot avea un rol similar cu membrana Descemet (15). Endoteliul apare redus ca dimensiune la corneea de caras auriu, în concordanță cu ceea ce s-a găsit și la alți pești, precum L. platyrhincus (15). Acest strat lipsește la unele elasmobranhii (19), ceea ce sugerează că are o funcție minimă în menținerea transparenței corneei, dar constituie o barieră majoră pentru transportul apei priri corneea acestor specii. Evidențierea GAG din corneea de Carassius auratus gibelio s-a realizat prin microscopie electronică, folosind tehnica de colorare cu roșu de ruteniu. Imaginile electronomicroscopice obținute evidențiază prezența GAG în stro- ma comeaiiă de caras, sub forma unor granule electronodense, dispuse ordonat între fibrilele de colagen, într-o manieră asemănătoare cu cea observată de noi în cazul stromei de comee bovină (fig. 11). Această similaritate privind organizarea 146 . Lucia Moldovan et al. 8 glicozaminoglicanilor și fibrilelor de colagen demonstrează că și în corneea de pește, ca și la vertebratele superioare, matricea polianionică de GAG este impor- tantă pentru menținerea constanta a distanțelor interfîbrilare colagenice și în hi- dratarea normală a țesutului, proprietăți absolut necesare menținerii transparenței corneene (22, 23). BIBLIOGRAFIE 1. MAURICE, D.M., The eye, Voi. 1B, Academic Press, New York, 1, 1984. 2. BERMAN, E.R., Biochemistry of the eye, Academic Press, New York, 89, 1991. 3. USHIKI, T., IDE, C., Cell Tiss. Res., 260: 175, 1990. 4. KOMAI, Y., USHIKI, T., Invest. Ophthalmol. & Vis. Sci., 32: 2244, 1991. 5. MOLDOVAN, L., ZĂRNESCU, O., OANCEA, A., TURCU, D„ Rev. Roum. Biol., 38 (2): 163, 1993. 6. KLYCE, S.D., BEUERMAN, R.W., The corneea, ChurchilI Livingstone Inc., New York, 3,1988. 7. BEUERMAN, R.W., PEDROZA, L., Microscopy Res. & Tech., 33: 320, 1996. 8. KREUTZIGER, G.O., Exp. Eye Res., 23: 285, 1976. 9. NICOL, J.A.C., The eyes offishes, Clarendon Press, Oxford, 1989. 10. SIVAK, J.G., The visual systetn offish, Chapman and Hali, London, 1990. 11. COLLIN, H.B., COLLIN, S.P., Histol. Histopathol., 10: 313, 1995. 12. HUNZIGER, E.B., LUDI, A., HERRMANN, W., J. Histochem. Cytochem., 40: 909, 1992. 13. CERNEA, R., Fiziologie oculară, Edit. Medicală, București, 27, 1986. 14. COLLIN, H.B., COLLIN, S.P., Corneea, 7: 190, 1988. 15. COLLIN, S.P., COLLIN, H.B., Brain Behav. Evol., 42: 98, 1993. 16. HARDING, C.V., BAGCHI, M., WEINSIEDER, A., PETERS, V., Invest. Ophthalmol., 13: 906, 1974. 17. EDELHAUSER, H.F., Comp. Biochem. Physiol., 24: 665, 1968. 18. VAN HORN, D.L., EDELHAUSER, H.F., SCHULTZ, R.O., J. Ultrastruct. Res., 26:454,1969. 19. KELLER, N., POULIQUEN, Y., The comea, Raven Press, New York, 253,1988. 20. MUNK, O., Vidensk. Meddr. DanskNaturh. Foren., 131: 109, 1968. 21. LYTHGOE, J.N., Lightas an ecological factor, Blackwell, Oxford, 211, 1976. 22. SCOTT, J.E., CUMMINGS, C., BRASS, A., CHEN, Y„ Biochem. I, 274: 699, 1991. 23. HADN, R.A., BIRK, D.E., Development, 115: 383, 1992. Primit în redacție la 30 mai 1997. * Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare pentru Științe Biologice, București, Splaiul Independenței, nr. 296. ** Facultatea de Biologie, București, Splaiul Independenței, nr. 91-95. ACȚIUNEA ZINCULUI ASUPRA MANTALEI, BRANHIILOR ȘI HEPATOPANCREASULUI DE LA Anodonta cygnaea (MOLLUSCA - LAMELLIBRANCHIATA) MARIA NĂSTĂSESCU, VIRGINIA POPESCU-MARINESCU, VIORICA MANOLACHE, CARMEN MARINESCU When zinc-intoxicated, the epithelia, branchiae, mantie and hepatopancreas of Anodonta cyg- naea undergo strong alterations, e.g. the disappearance of cell membranes and cilia, pycnosis of the nuclei, or even the complete disintegration of the cells. Likewise, important alterations of the conjunctive tissues present in these structures were noticed. Metalele grele, prin afinitatea puternică și interacțiunea cu anumiți liganzi și macromolecule din organismele vii pot să devină foarte toxice pentru viețuitoarele din mediul acvatic. Metalele grele traversează membrana plasmatică și interacționează cu struc- turile citosolice, prin formarea de complexe metaloorganice, sau prin modificarea unor etape din metabolismul intermediar. Unele metale, ca de exemplu, Cd, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, considerate elemente esențiale, activează anumite enzime și astfel influențează funcțiile fiziologice ale diferitelor organe. Acțiunea acestor metale, în diferite concentrații, privind modificările produ- se asupra țesuturilor la nevertebrate, inclusiv la anumite moluște, a mai fost abor- dată de unii autori (3), (5), (12). Zincul este un microelement indispensabil organismului, dar în situațiile în care depășește anumite limite de concentrație devine nociv. însă, există puține date referitoare la metabolismul zincului la nevertebrate (3), (13). în lucrarea de față, am urmărit modificările cito-histologice la nivelul mantalei, branhiilor și hepatopancreasului, produse prin acumularea zincului în organism. MATERIAL ȘI METODĂ De la exemplarele martor și de la cele intoxicate timp de 96 ore cu doze de 0,3 si 0,8 mg/1 Zn (din ZnSO4) s-au prelevat porțiuni de hepatopancreas, branhii externe și interne, ca și de manta. St. cerc, biol., Seria biol, anim., t. 49, nr. 2, p. 147-155, București, 1997 148 Maria Năstăsescu et al. 2 Aceste piese fixate în Bouin și formol calcic au fost prelucrate prin tehnici histologice clasice; secțiunile au fost colorate cu hemalaun-eritrozină, Azan, PAS. Menționăm că intoxicarea exemplarelor de Anodonta cygnaea a avut loc în condițiile testelor statice, în care variațiile principalilor factori mediali s-au produs în limite strânse. REZULTATE Ambele doze utilizate timp de 96 ore s-au dovedit subletale pentru Anodonta cygnaea. Dar, testul prelungit la 7 zile a arătat că doza de 0,8 mg/1 'Zn este toxico-letală. Mantaua la Anodonta cygnaea este căptușită de un epiteliu paleal care mărginește cavitatea mantalei și un epiteliu extrapaleal ce fațetează cavitatea din- tre manta și cochilie. La exemplarele martor, epiteliile mantalei sunt unistratificate (fig. 1), consti- tuite din celule prismatice prevăzute cu cili, printre care se găsesc intercalate celu- le mucoase. Celulele sunt mai joase către cei doi poli ai mantalei, iar spre mijloc mai înalte. Sub epiteliu există țesut conjunctiv cu elemente sanguine. Tot în țesutul conjunctiv sunt prezente vase limfatice și mușchi cu orientare diferită. Fig. 1 - Anodonta cygnaea, manta de la exemplar martor: a - epiteliu; b - țesut conjunctiv. 3 Acțiunea zincului asupra unor organe la Anodonta cygnaea 149 în intoxicarea cu doza de 0,3 mg/1 Zn, structura mantalei este foarte mult afectată. Astfel, epiteliul apare complet distrus (fig. 2) și nu se mai remarcă cilii celulelor prismatice. Celulele mucoase nu se mai disting. La ambele tipuri de celu- le, limitele celulare dispar, nucleii sunt picnotici. Uneori, epiteliul este pluristrati- ficat. Polurile apicale ale celulelor apar întotdeauna distruse. Țesutul conjunctiv de sub epiteliu este degradat, nucleii celulelor conjunctive ca și ai elementelor figurate sunt picnotici. De asemenea s-au degradat și fibrele musculare. Fig. 2 - Anodonta cygnaea, manta de la exemplar intoxicat cu doza de 0,3 mg/1 Zn: a - epiteliul mantalei distrus complet. La doza de 0,8 mg/1 Zn, epiteliul mantalei în multe porțiuni își păstrează integritatea; în alte zone, se observă distrugerea completă a acestuia. Uneori celu- lele își reduc diametrul transversal, apropiindu-se foarte mult; nucleii apar alungiți, alteori complet degradați. Celulele mucoase situate la baza celor ciliate, rar distru- se, apar turtite în unele zone; nucleii lor sferici au cromatina bine păstrată, dar citoplasmă vacuolizată. Țesutul conjunctiv și cel muscular sunt pe alocuri complet degradate (fig. 3). Structura branhiilor interne si externe, prelevate de la exemplare intoxica- te cu Zn, ca și în cazul mantalei, a fost comparată cu structura branhiilor de la lotul martor de Anodonta cygnaea. Nu insistăm asupra aspectului normal deoarece acesta a fost deja descris de Manolache și colab. (7). Astfel, la doza de 0,3 mg/1 Zn, branhiile externe își păstrează mai bine struc- tura (fig. 4). Sunt afectate în special branhiile interne, care au epiteliul pe alocuri complet distrus. Celulele sunt dezintegrate și apar risipite. Nucleii sunt picnotici, cilii distruși. în multe cazuri, la fel de afectate sunt și vasele sanguine care există în axul branhiei. Endoteliul vaselor uneori este degradat. Țesutul conjunctiv se modi- 5 Acțiunea zincului asupra unor organe la Anodonta cygnaea 150 Maria Năstăsescu et al. Fig. 3 - Anodonta cygnaea, manta de la exemplar intoxicat cu doza de 0,8 mg/1 Zn: a - epiteliul mantalei; b - țesut conjunctiv. Fig. 4 - Anodonta cygnaea, branchie externă de la exemplar intoxicat cu doza de 0,3 mg/1 Zn: a - epiteliu branchial; b - țesut conjunctiv. fică, iar nucleii apar picnotici. în aceiași măsură este afectată și musculatura. în unele zone întreaga structură a branhiei este foarte puternic degradată (fig. 5). La doza de 0,8 mg/1 Zn, în general, branhiile interne își păstrează aspectul normal. Totuși, pe alocuri, lamele branhiale apar rupte și degradate, iar epiteliul branhiei este afectat: celulele au înălțimea mai mică, limitele celulare uneori dis- par nucleii devin picnotici (fig. 6). Parțial, țesutul conjunctiv din interiorul bran- hiei este lizat. Uneori, se remarcă existența unor celule conjunctive cu nudei picnotici, care împing celulele bazale ale epiteliului bazai. Sunt distruse de aseme- nea și celulele sanguine. Fig. 5 - Anodonta cygnaea, branchie internă de la exemplar intoxicat cu doza de 0,3 mg/1 Zn: a - epiteliu branchial; b - țesut conjunctiv. Fig. 6 - Anodonta cygnaea, branchie internă de la exemplar intoxicat cu doza de 0,8 mg/1 Zn: a - țesut branchial; b - țesut conjunctiv. 152 Maria Năstăsescu et al. 6 7 Acțiunea zincului asupra unor organe la Anodonta cygnaea 153 în ceea ce privește branhiile externe, acestea pe alocuri își păstrează aspectul normal, alteori sunt distruse. Epiteliul branhial este degradat. Suferă modificări si unele componente ale țesutului conjunctiv. Hepatopancreasul de la exemplarele intoxicate cu zinc a fost comparat ca structură cu cel de la martor. Și la acest organ, aspectul normal a fost descris la Anodonta cygnaea și de alți autori (7). La doza de 0,3 mg/1 Zn tubulii hepatopancreasului apar, în general, complet dezorganizați. Sunt porțiuni întregi unde structurile sunt așa de distruse încât nu se recunoaște hepatopancreasul ca organ. Atât celulele clare cât și cele mai întuneca- te sunt degradate total și întregul preparat apare plin cu nudei picnotici și dâre de citoplasmă (fig. 7). Rar se mai remarcă forma unui tubul hepatopancreatic, dar în această situație, celulele epiteliului apar distruse. Uneori se observă nucleii picno- tici. La fel de dezorganizat este țesutul conjunctiv din jurul tubulilor, în care dis- tingem nudei picnotici ai celulelor conjunctive, sau ai elementelor sanguine, precum și urme de fibre conjunctive. Fig. 7 - Anodonta cygnaea, hepatopancreas de la exemplar intoxicat cu doza de 0,3 mg/1 Zn: a - țesut total dezorganizat. La doza de 0,8 mg/1 Zn se întâlnesc în hepatopancreas atât tubuli distruși, dar și tubuli în care integritatea este păstrată (fig. 8). Ceea ce se remarcă în acești tubuli, uneori integri, este faptul că celulele clare apar foarte vacuolizate, limitele dintre ele dispărând și rămânând fie nudei total picnotici, fie cu cromatină foarte aglutinată. Celulele întunecate se pare că sunt puțin afectate; la ele nucleii au aspect normal. Dar, și la aceste celule, uneori, limitele celulare dispar, alteori ele sunt slab distinc- te. Țesutul conjunctiv prezintă nucleii celulelor conjunctive și sanguine picnotici, ’,T,eori se mai păstrează amibocite în care sunt prezente granulați! eosinofile. Fig. 8 - Anodonta cygnaea, hepatopancreas de la exemplar intoxicat cu doza de 0,8 mg/1 Zn: a - țesut parțial dezorganizat. DISCUȚII Toxicitatea unor metale grele a fost studiată în special în ceea ce privește hepatopancreasul, organ în care se produc degradări destul de pronunțate (9). După unii autori, metalele endocitate în celule ajung în diferite compartimente celulare și se acumulează în special în mitocondrii sau lizozomi (3). La multe specii de nevertebrate, se arată că, prin înglobarea metalelor se formează depozite minerale intracelulare, care constituie granule înconjurate de membrane. Astfel de granule au fost descrise din hepatopancreasul de Lymnaea stagnalis, Helixaspersa (Gastropoda) (10), (11), Balanus balanoides și Carcinus moenas (Crustacea) (4), (14). Formarea granulelor este interpretată ca un meca- nism de detoxifiere a citoplasmei celulelor digestive. Atât din observațiile noastre cât și din datele existente în literatura de speci- alitate reiese că hepatopancreasul este organul cel mai sensibil la acțiunea poluanților. Astfel, noi am observat degradarea structurii acestuia, sub acțiunea dozelor de 0,3 mg/1 și 0,8 mg/1 Zn. în acest sens, am remarcat distrugerea uneori totală, în special, a celulelor clare, vacuolizarea citoplasmei, picnoza nucleilor, dispariția membranelor plasmatice și împrăștierea celulelor în lumenul tubulilor. în cazul ruperii membranelor bazale din jurul tubulilor am observat infiltrarea amibocitelor. Așa cum s-a descris și de către alți autori (3), Zn se acumulează fie în amibo- cite, fie în granule intracelulare în diverse organe. Lowe (6) a remarcat la Mytilus edulis prezența zincului din citoplasmă celulelor tubului digestiv. 154 Maria Năstăsescu et al. 8 9 Acțiunea zincului asupra unor organe la Anodonta cygnaea 155 Efectul metalelor grele asupra mantalei și branhiilor a fost puțin cercetat la moluște; dintre studiile existente asupra acestor organe, mai multe se referă însă la efectul Cu, Cd, Mn, (1), (2), (5), (7), (12), decât la cel al Zn. în urma Unei analize a rezultatelor obținute prin cercetările noastre subliniem că, deși în general, răspunsul unui organism este în relație directă cu doza toxicului utilizată în experiment, nu este surprinzător că o concentrație mai mică a unei substanțe nocive produce efecte mai puternice decât o doză.mai ridicată, așa cum s-a întâmplat în cazul exemplarelor de Anodonta cygnaea. în sensul unui răspuns al animalelor invers proporțional cu concentrația toxi- cului, pledează cercetările lui Salih și colab. (8), care referindu-se la bioacumula- rea cuprului și zincului menționează că, în musculatura peștelui Varicorhinus trutta rata de acumulare este invers proporțională cu concentrația din apă a respectivelor metale. Pe de altă parte, aceiași autori subliniază că rata de acumulare a Mn în mușchii și branchiile de Varicorhinus trutta a fost mai mult, sau mai puțin egală la o expunere a animalelor la concentrațiile de la 1 până la 1,5 ppm Mn (8). CONCLUZII Rezumând rezultatele cercetărilor noastre, putem afirma că în cazul intoxi- cării cu zinc am constatat Ia specia Anodonta cygnaea modificări destul de pronunțate ale structurii hepatopancreasului, branchiilor și mantalei. Degradările constau în dispariția limitelor celulare, distrugerea uneori completă a celulelor, picnoza nucleilor, dispariția cililor, atât la celulele mantalei, cât și ale branhiilor. De asemenea, am remarcat distrugerea țesutului conjunctiv și a musculaturii. Concluzia generală care se desprinde este că, Zn chiar în concentrații subletale, în timp de 96 ore, produce modificări ireversibile la nivelul structurii unor organe vitale. Prin acumularea în timp a toxicului, se ajunge la moartea organismelor. BIBLIOGRAFIE 1. ANDERSEN J.T., B AATRUPE, Aquatic Toxic., 13: 309-324, 1988. 2. ENGEL D.W., FOWLER B.A., Marine Pollution, Function responses, Acad. Press. Inc., Lon- don, 239-256, 1979. 3. GEORGE S.G., BRIAN J.S., PIRIE, J. mar. biol. Ass, U.K., 60: 575-590, 1980. 4. HOPKIN S.P., NOTT S.A., J. mar. biol. Ass, U.K., 56: 867-877, 1979. 5. LAUTIE N., CARRU A.M., TRUCHET M., Malacologie, 29: 405-4117, 1988. 6. LOWE D.M., MOORE M.M., J. mar. biol. Ass., U.K., 59: 851-858, 1979. 7. MANOLACHE V., POPESCU MARINESCU VIRGINIA, NĂSTĂSESCU M., MARINESCU C„ Revue roum. biol., Serie Zool., 42: (1): 41-48,1997. 8. SALIH T.N., O.A.N. AL-HABBID, H.N. EHMAYED, Abstracts, XXI, SIL Congress, Kyoto, 235, 1980. 9. SARASQUETTE M.C., GONZALES M.L., GIMENO S., Eur. J. Histochem, 36:223-232,1992. 10. SIMINAT., BOSS J.L., J. of Zoology, 27: 195-208, 1977. 11. SIMIKINS K., Biomineralization anddetoxification Calcified Tissue Research, 24:199-200,1977. 12. SUNILLAI., Limologica (Berlin), 15: 523-527, 1984. 13. THOMAS P.B., RETZ D.A., Mar. biol., 90: 255-260,1986. 14. WALKER G., RAINBOW P.S., FOSTER P., HOLLAND D.L., Mar. biol., 33:168-166,1975. Primit în redacție la 30 mai 1997. * Universitatea București, Facultatea de Biologie. ** Institutul de Biologia Dezvoltării. INSTABILITATEA CROMOZOMIALĂ CONSTITUȚIONALĂ ÎN CANCERUL DE COLON ZORICA-ILEANA HERTZOG, M. CRUCE, V. PÎRVULESCU, R. HERTZOG* It has been established that chromosomal stability is a sine qua non condition for a normal development of cellular events. Alteration of ecogenetic equilibrium causes chromosomal instability, generating both an abnormal segregation of genetic material and chromosomal reshaping. This paper deals with spontaneous and cyclophosphamide-induced chromosomal instability in patients with colon and rectal neoplasms. Chromosome analysis in lymphocyte cultures indicates a spontaneous instability in 20% of the studied cases and an induced one in 80%. Instability consists in various chromosomal aberrations: chromatid and chromosome breaks, centromeric breaks, dicentric chromosomes, or small double chromosomes (dms). This study sustains the necessity of a genetic consultation for subjects with a high risk for cancer. Instabilitatea cromozomială constituțională sau indusă poate constitui un marker al predispoziției genetice la cancer (8). Instabilitatea cromozomială se manifestă prin anomalii constituționale cromozomiale, situsuri fragile și hipersen- sibilitate la mutageni-clastogeni (2). Anomaliile constituționale cromozomiale pot determina dezvoltarea de ti- puri specifice de cancer. De pildă, indivizii cu deleții sau translocații care implică regiunea 22ql 1 sunt predispuși la meningioame, aceia care prezintă translocații ce implică 3pl4 sunt predispuși la cancer renal, iar cei cu deleții ale cromozomilor 1 lpl3 și 13ql4 sunt predispuși dezvoltării de tumori Wilms și retinoblastom. Situsurile fragile predispun indivizii purtători la dezvoltarea diferitelor malignități. Exprimarea fenotipică a acestor situsuri reclamă un mediu de cultură al celulelor, lipsit de folat. De pildă, situsul lp!4, care este cunoscut ca un situs fragil comun, apare la majoritatea pacienților afectați de polipoza adenomatoasă familială. Al treilea tip de anormalități citogenetice, care a fost, frecvent corelat cu predispoziția la cancer, este sensibilitatea la mutageni. De pildă, pacienții cu sin- droame de „rupere cromozomială” sunt predispuși la leucemii. O caracteristică a pacienților cu ataxie telangiectazică (AT) și cu anemie Faconi (AF) o constituie sensibilitatea celulelor la mutageni care induc rupturi cromozomiale, celulele AT simt sensibile la radiații ionizante și bleomicină, iar celulele AF sunt sensibile la agenți alchilanți. în mod similar, celulele pacienților cu sindrom Gardner, predispuși cancerului de colon, sunt sensibile la radiațiile X (5). St. cerc, biol., Seria biol, anim., t. 49, nr. 2, p. 157-163, București, 1997 158 Zorica-Ileana Hertzog et al. 2 Așadar, determinarea instabilității cromozomiale spontane sau induse este o metodă de diagnostic a stării precanceroase și se impune ca măsură a sfatului ge- netic în detectarea precoce a indivizilor susceptibili la cancer. In acest context ne-am propus să efectuăm un studiu citogenetic asupra sensibilității limfocitelor obținute de la pacienți cu cancer de colon la ciclofosfa- midă - un citostatic cu proprietăți clastogenice. MATERIAL ȘI METODĂ Au fost investigări citogenetic 15 pacienți (11 bărbați și 4 femei) cu cancer de colon, dintre care unii prezentau o dublă localizare. în ce privește repartizarea cancerului de colon pe grupe de vârstă, din cei 15 pacienți luați în studiu, unul aparținea grupei de vârstă de 20-45 de ani, trei aparțineau grupei de vârstă 46-55 de ani, șase aparțineau grupei de vârstă 56-65 de ani, iar cinci aveau vârsta de peste 65 de ani. De asemenea, zece cazuri proveneau din mediul urban și cinci cazuri din mediul rural. Cazul care aparținea primului grup de vârstă a prezentat leziuni unice cu degenerare rapidă pe fond genetic, iar cazurile cu vârsta peste 55 de ani au prezen- tat leziuni multiple care degenerează malign sub influența factorilor de risc ce agresează mucoasa colică. Pentru fiecare caz, au fost inițiate două culturi de limfocite care au fost cres- cute pentru 72 de ore în mediu MEM suplimentat cu 10% ser de vițel și PHA-M. O cultură din cele două a fost tratată cu ciclofosfamidă (CP) în concentrație finală de 0,2 mg/ml mediu de cultură, urmărind aberațiile cromozomiale induse, iar cealaltă cultură a servit pentru studiul aberațiilor cromozomiale spontane. Paralel, au fost inițiate culturi de limfocite de la donori de sex masculin și feminin, care au servit ca probe de control. Tehnica preparării cromozomilor a inclus: blocarea mitozelor în metafază cu colcemid în concentrație finală de 0,1 pg/ml pentru două ore la +37°C; hipotonie cu soluție de KC1 (0,075 M) pentru 10 minute la +37°C; 3 fixări cu amestec de metanol/acid acetic glacial (3:1) pentru 30 minute la +4°C; efectuarea lamelor cromozomiale care au fost colorate cu soluție Giemsa 10%. REZULTATE ȘI DISCUȚII Rezultatele analizei citogenetice a cazurilor prezentate sunt sintetizate în figura 1. Analiza aberațiilor cromozomiale relevă o rată normală a rupturilor spontane în 11 cazuri și o rată crescută a aberațiilor spontane în 3 cazuri (18%, 15%, 19,06%). în urma expunerii culturilor de limfocite la ciclofosfamidă (CP), rata aberațiilor cromozomiale crește semnificativ în 12 cazuri, în 3 cazuri frecvența aberațiilor 3 Instabilitatea cromozomială constituțională 159 nedepășind 6%. Această observație ne-a determinat să analizăm arborele genealo- gic al cazurilor luate în studiu. în 10 cazuri, analiza genealogică a relevat diferite forme de cancer și la alți membri ai familiei. Așa cum se observă în figura 2 (ca- zul 4), fiecare generație este afectată. 1-F2 a prezentat tumora Wilms, 5-F2 - car- cinom ovarian, 5-F3 - cancer la stomac. Fig. 1 - Frecvența modificărilor cromozomiale spontane și induse „in vitro”, la pacienții investigaîi. Fig. 2 - Arborele genealogic al cazului 4. FI F2 F3 F4 Zorica-Ileana Hertzog et al. 4 5 Instabilitatea cromozomială constituțională 161 Fig- 3 - Metafază prezentând cromozomi minusculi dubli. Fig. 5 - Metafază prezentând multiple aberații: A - ruptură cromatidică; B - translocație; C - deleție. Fig. 4 - Aspect dintr-o metafază prezentând un cromozom dicentric. Spectrul aberațiilor cromozomiale a inclus: rupturi cromatidice și cromozo- miale, cromozomi minusculi dubli, cromozomi dicentrici, interschimburi, frag- mente acentrice și lacune. Figurile 3, 4 și 5 ilustrează câteva dintre aberațiile cromozomiale identificate mai frecvent. Dintre aberațiile cromozomiale, rupturile și cromozomii dicentrici au apărut cu o frecvență de 70% - în toate cazurile cu frecvență semnificativă a acestora. Cromozomii minusculi dubli au apărut cu o frecvență de 7,6% din totalul aberațiilor. Adenomatoza colonului și a rectului (ACR) este o boală autozomal-domi- nantă, asociată cu cancer unde apariția posibilă a instabilității genomice a fost foarte mult cercetată. O serie de studii arată o rată normală a rupturilor spontane și o sensibilitate crescută a celulelor când acestea au fost expuse unui clastogen (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) (5). Dacă rearanjamentele cromozomia- le constituie un element esențial în cancerogeneză, atunci fragilitatea cromozomi- ală ar putea fi asociată cu un risc crescut al dezvoltării cancerului. Orice individ cu tendința de a dezvolta rupturi va reflecta doi parametri: expunerea la mutageni și stabilitatea cromozomială inerentă. Este evident că parametrii genetici se asociază cu cei ai mediului pentru a determina efectul unui proces biologic. în funcție de răspunsul individual la expunerea mutagenică, au fost sugerate 4 oncodeme cu risc diferit la cancer: prima oncodemă include cancerele care se dezvoltă din mutațiile spontane cauzate de radiațiile cosmice; a doua oncodemă 162' Zorica-Ileana Hertzog et al. 6 7 Instabilitatea cromozomială constituțională 163 include tumorile care se dezvoltă ca răspuns Ia expunerea mutagenică în exces; a treia oncodemă include tumorile care rezultă din incapacitatea constituțională de a răspunde la provocările induse de clastogeni; a patra oncodemă include cancerele în care influența mediului înconjurător pare să fie neglijabilă. Cele mai frecvente cancere fac parte din oncodemele 2 și 3 (1,5). Sensibilitatea celulelor la mutagen nu poate fi explicată decât la nivel mole- cular. La sfârșitul anului 1993 a fost descoperită prima genă a susceptibilității la cancerul de colon fără polipi. Această genă, numită hMSH2,^stQ omoloagă genei mutS de la Escherichia coli. Prin tehnica RFLP, gena a fost localizată pe cromozo- mul 2pl5-16. La începutul anului 1994 a fost descrisă o a doua genă a suscep- tibilității la cancerul familial de colon -■ hMLHl - omoloagă genei mutL de la 5. cerevisiae. Alte două gene - hPMSl și hPMS2 - omoloage genei yPMSl de la levuri au fost descrise ca fiind implicate în susceptibilitatea la această formă de cancer (4,6,7). Se sugerează că alimentele și proliferarea microbilor în colon supun mucoa- sa colică unei agresiuni mutagene permanente la care organul poate rezista datori- tă integrității sistemelor de reparare care elimină leziunile. Anomaliile sistemelor de reparare sensibilizează mucoasa colică la efectul oncogenic al mutagenilor de origine alimentară sau microbiană. Gena pentru ACP (adenomatoza colică cu polipi) a fost localizată pe cromo- zomul 5q21 și, în diferite tipuri de cancere digestive, această genă prezintă câte o mutație (7). A fost demonstrată o interacțiune puternică între o regiune de aproxi- mativ 15 aminoacizi, a proteinei ACP și cateninele alfa și beta. Cateninele sunt localizate la nivelul joncțiunilor aderente dintre epitelii, asigurând inhibiția de con- tact. Aceste joncțiuni sunt constituite din caderine, proteine transmembranare, a căror porțiune extracelulară intervine în interacțiunile homotipice dintre caderine- le celulelor adiacente. Prin domeniul lor intracelular, caderinele interacționează cu cateninele alfa și beta, la care se leagă actinele citoscheletului (3, 9). Relațiile dintre citoschelet și moleculele de aderență intercelulară, pe de o parte, și cancer, pe de altă parte, sunt, deja, cunoscute. Modificarea moleculelor de aderență con- duce în mod sigur la dezvoltarea metastazelor. CONCLUZII Pe baza rezultatelor obținute putem conchide următoarele: 1) Fragilitatea cromozomială spontană, semnalată în trei cazuri și cea indusă de ciclofosfamidă în 12 cazuri pledează în favoarea unei relații între stabilitatea/ instabilitatea cromozomială și riscul la cancer. 2) Dacă instabilitatea genomică nu poate fi determinată direct, expunerea la clastogeni sau radiații devine obligatorie pentru studiul fragilității cromozomiale la persoanele cu risc crescut la cancer. BIBLIOGRAFIE 1. AXEL K., Genetique du cancer colo-rectal, Medecine/Sciences, 10: 228-229, 1994. 2. BOONEY D.E., CZEPULKOWSKI B.H., Human Cytogenetics - A Practicai Approach, IRL PRESS at Oxford University Press, 1992. 3. CRUCE M., CRUCE ROXANA, ZAHARIA B., Adeziunea celulară și matricea extracelulară, Edit. Aius, Craiova, 1997. 4. GILGENKRANTZ HELENE, Susceptibilite au cancer colique et instabilite de l’ADN: un nou- veau gene localise, M€decine/Sciences, 9: 15-16, 1993. 5. HEIM S., IOHANSSON B., Constituțional chromosome instability and cancer risk, Mutation Research, 221: 39-51, 1989. 6. HERTZOG ZORICA ILEANA, Elemente de genetică moleculară, Edit. Didactică și Pedago- gică, București, 1996. 7. RUBINFELD B., SOUZA B., ALBERTI., MULLER O., Association of the APC gene product with catenin, Science, 262: 1731-1734, 1993. 8. ȘTEFĂNESCU D., CĂLIN G., Genetica și cancerul, Edit. Didactică și Pedagogică, București, 1996. 9. SU L.K., VOGELSTEIN B., KINZLAR K.W., Association of the APC tumor suppressor pro- tein with catenins, Science, 262: 1734-1737, 1993. Universitatea din Craiova, Facultatea de Medicină, Departamentul de genetică Craiova, str. Petru Rareș, nr. 4. * Universitatea de Medicină și Farmacie „ Carol Davila ”, București. Primit în redacție la 10 martie 1997. MODIFICAREA COMPOZIȚIEI CHIMICE ȘI SCĂDEREA ÎN GREUTATE LA PUIETUL DE CRAP SUB INFLUENTA PERIOADEI DE IERNAT > ALICE VASILE-ȘERBĂNESCU, AL. G. MARINESCU*, D.VIZITIU The Chemical composition of the body, the weight and the condition factor (Fulton) of finger- lings from three races of common carp (Frăsinet, Ineu and Ropsa) were examined before and after the winter season. The values of the condition coefficient (Fulton) of fingerlings from these three races were found before the winter season, over the optimal levels required for a good survival during the winter. The greatest weight, fat and protein content losses during the winter season were found to fingerlings from Frăsinet and Ropsa races, the fingerlings of Ineu races resisting better to winter conditions. Cunoașterea compoziției chimice a organismului permite aprecierea stării generale de întreținere a materialului piscicol, oferind informații, asupra posibilităților de depășire a perioadei de iarnă de către crap, precum și a modului de valorificare a bazei trofice naturale și a diferitelor rețete de furajare. Totodată, poate fi stabilită valoarea comercială a cărnii peștelui și sunt obținute date cu pri- vire la parametrul biochimic care trebuie îmbunătățit în acțiunile de ameliorare (Love, 9; Steffens, 14). In perioada de iarnă, peștii înregistrează pierderi în greutate influențate de o serie de factori: temperatura apei, starea lor fiziologică generală, vârsta și greuta- tea peștelui introdus în heleșteele de iernat etc. Obiectivul acestui studiu este aprecierea modificării nivelului principalilor con- stituenți chimici ai corpului (apă, grăsime, proteine, substanțe minerale) și a valo- rilor coeficientului de condiție (Fulton), determinarea reducerii greutății la puietul de crap care aparține raselor Frăsinet, Ineu și Ropsa, datorate perioadei de iarnă. MATERIAL ȘI METODĂ Materialul experimental care face obiectul acestui studiu este reprezentat de puiet de crap, aparținând raselor Frăsinet, Ineu și Ropsa, din heleșteele experimen- tale care aparțin S.C.P. Nucet. * Institutul de Biologie București, Academia Română, Laboratorul de Fiziologie animală St. cerc, biol., Seria biol, anim., t. 49, nr. 2, p. 165-172, București, 1997 166 Alice-Vasile Serbănescu et al. 2 3 Compoziția chimică a corpului la crap 167 Peștii au fost colectați din heleștee la începutul și la sfârșitul sezonului de iernat: un număr de 65 de pești (25 exemplare Frăsinet, 20 exemplare Ineu, 20 exemplare Ropsa) în perioada 21 oct.-15 nov. 1996, respectiv 70 de pești (25 exemplare Frăsinet, 20 exemplare Ineu, 25 exemplare Ropsa) în perioada 12 mart-14 apr. 1997. Materialul experimental a fost transportat din heleștee în laborator și contenționat în recipiente umplute cu apă de robinet, fiind supus unei perioade de inaniție de 24 ore în vederea eliminării conținutului intestinal. Ulterior, peștii au fost congelați în pungi de plastic, închise ermetic, pentru o perioadă de maxim 30 zile, timp în care s-a efectuat analiza chimică a acestora. Toți peștii au fost analizați individual. Au fost urmăriți următorii parametri: WX100 greutatea, lungimea standard și s-a calculat coeficientul Fulton (K =----------), unde K = coeficientul Fulton, W = greutatea, 1 = lungimea standard (lungimea cor- pului fără înotătoarea caudală). Metodele de analiză utilizate sunt cele folosite în mod curent în laboratoarele de biochimie animală: umiditatea probelor s-a determinat prin uscarea acestora în etuvă la 110°C, grăsimea (lipidele totale) prin metoda Folch modificată de Dumi- tru (2) proteina brută prin metoda Kjeldahl, iar conținutul în substanța minerală prin calcinare în creuzete de platină până la masa constantă. REZULTATE Pe baza rezultatelor obținute au fost calculate valorile medii pentru fiecare parametru investigat (prezentate în tabelul nr. 1). z Tabelul nr. 1 Greutatea, coeficientul Fulton și compoziția chimică la puietul de crap care aparține raselor Frăsinet, Ineu și Ropsa, anterior și la sfârșitul perioadei de iarnă. RASA FRĂSINET INEU ROPSA SEZONUL Toamna Primăvara Toamna Primăvara Toamna Primăvara NR. PEȘTI ANALIZAȚI 25 25 20 20 20 25 GREUTATEA (g) 17,78 14,14 30,12 25,68 11,91 9,82 COEF. FULTON (K) 3,14 2,64 2,50 2,28 2,98 2,48 COMPOZIȚIA CHIMICĂ (%) APA (%) 77,11 80,24 79,66 80,79 78,91 81,69 SUBST. USCATĂ (%) 22,88 19,75 20,33 19,20 21,08 18,30 GRĂSIME (%) 4,67 2,09 3,50 2,52 4,13 2,67 PROTEINE (%) ■ 16,37 14,50 15,18 4,85 15,80 13,87 CENUȘĂ (%) 1,03 1,21 0,87 1,06 0,96 1,13 Puietul de crap luat în studiu prezenta la sfârșitul perioadei vegetative, ante- rioare iernării, o greutate medie cuprinsă în intervalul de variație 11,91-30,12 g, la sfârșitul perioadei de iemare greutatea variind între 9,82-25,68 g. Greutatea cea mai mică s-a înregistrat la exemplarele de crap din rasa Ropsa. Scăderea în greutate înregistrată la cele trei rase de crap luate în studiu a fost de 20,47% pentru puietul din rasa Frăsinet, 14,74% pentru puietul din rasa Ineu și 17,54% pentru puietul din rasa Ropsa. Coeficientul Fulton (K) reprezenta anterior perioadei de iernare valorile: K - 3,14 pentru rasa Frăsinet, K = 2,50 pentru rasa Ineu, K = 2,98 pentru rasa Ropsa, iar la sfârșitul iernării K = 2,64 pentru rasa Frăsinet, K = 2,28 pentru rasa Ineu, K = 2,48 pentru rasa Ropsa. Grăsimea (lipidele totale) conținută în corpul peștilor anterior iernatului va- riază între 3,50% (nivel corespunzător puietului de crap din rasa Ineu) și 4,67% (nivel corespunzător puietului de crap din rasa Frăsinet). La sfârșitul sezonului de iernat, datorită consumului energetic, nivelul acestui indicator ajunge la 2,52% (pentru puietul de crap Ineu), respectiv 2,09% (pentru puietul de crap Frăsinet). Proteina brută conținută în corpul peștilor anterior iernatului se caracterizea- ză prin valorile 15,18% (pentru rasa Ineu), 15,80% (pentru rasa Ropsa), 16,37% (pentru rasa Frăsinet), nivelul cel mai scăzut observându-se la exemplarele din rasa Ineu. La sfârșitul perioadei de iernat valorile înregistrate se încadrează în intervalul de variație 13,87%-14,85%, puietul de crap care aparține rasei Ropsa reprezentând procentul cel mai scăzut de proteină brută. Conținutul în apă al celor trei grupe de pești analizate variază în intervalul 77,11%-79,66% anterior iernării, respectiv 80,24%-81,69% la sfârșitul sezonului de iernat. Substanța minerală (cenușa) conținută în corpul peștilor luați în studiu, la sfârșitul perioadei vegetative înregistra următoarele valori medii: 1,03% pentru rasa Frăsinet, 0,87% pentru rasa Ineu, 0,96% pentru rasa Ropsa, iar la sfârșitul iernării valorile înregistrate fiind ușor ridicate: 1,21% pentru rasa Frăsinet, 1,06% pentru rasa Ineu, 1,13% pentru rasa Ropsa. DISCUȚII în timpul iernării peștii înregistrează pierderi în greutate, nivelul acestor pier- deri fiind dependent de starea de întreținere și de temperatura apei. Cu cât iarna este mai caldă, iar peștii mai slabi, cu atât pierderile sunt mai mari, ajungând une- ori până la 20-25%; dacă temperatura din timpul iernii este mai scăzută, iar peștii mai grași, procentul de pierderi în greutate este mai mic (9). Ca urmare a scăderii temperaturii apei în timpul iernării, crapul devine din ce în ce mai puțin activ, iar la temperaturi foarte scăzute (l-0°C), intră în starea de hibernare. Temperatura apei, cea mai potrivită pentru iernat, este de 0,5-1 °C, iar 5 Compoziția chimică a corpului la crap 169 106 Ahce-Vasile Șerbănescu etal. ( 4 creșterea temperaturii peste acest prag determina crapul să iasă din starea de hiber- nare, acesta începând să înoate fără a se putea hrăni, consumându-și rezervele energetice și pierzând astfel din greutate (8). Condițiile hidrochimice, în special concentrația oxigenului solvit în apă și reacția apei, sunt factori care au o influență mare asupra iemării crapului; o supra- saturare a apei cu oxigen activează procesele fiziologice ale organismului, determinându-1 să se miște mai mult și să slăbească (8). Pe toată durata experimentului s-a urmărit variația temperaturii apei, cantita- tea de oxigen solvit în apă, pH-ul apei. Valorile medii lunare ale temperaturii apei, înregistrate în perioada de iarnă au fost: 1,5°C în luna decembrie, 2°C în luna ianuarie, 2,5°C în luna februarie, 6,6°C în luna martie. Concentrația oxigenului solvit în apă a variat în perioada de iarnă în interva- lul 10,28-11,83 mg O2/l, Havelka recomandând ca în apa heleșteelor de iernat concentrația O2 solvit să nu scadă sub 4 cm3/l (5), Kirpicinikov considerând un necesar de cel puțin 8-9 mg O2/l (5). Reacția apei a fost normală pe toată perioada iemării, pH-ul prezentând valoa- rea medie de 7,5 (grade pH). Temperaturile joase și lipsa hranei din timpul iernii conduc la modificarea unor indici morfologici (coeficientul de condiție Fulton) și biochimici (apă, grăsi- me, proteine, substanță minerală), fiind afectată starea fiziologică generală a peștelui și astfel capacitatea sa de supraviețuire. Starea de întreținere a peștelui poate fi apreciată după nivelul principalilor constituenți chimici ai corpului și valorile coeficientului de condiție. La începutul iernatului, puietul de crap care aparține raselor Frăsinet și Rop- sa, spre deosebire de crapul Ineu, se caracterizează prin greutăți medii situate sub greutatea optimă (30 g), care este considerată a asigura o iemare a crapului de o vară, în bune condiții (9). Luarea în considerare numai a greutății medii înregistrată în timpul perioadei de iemare, nu furnizează informații exacte la rezistența puietului de crap la condițiile precare de viață oferite în timpul iemării, astfel încât trebuie să se ia în considerare și gradul său de îngrășate. Coeficientul Fulton (factorul de condiție, coeficient de îngrășare), indicator care exprimă gradul de îngrășare al materialului piscicol, permite aprecierea posibilității depășirii perioadei de iama de către crap. Pentru o iemare în bune condiții și cu o pierdere în greutate redusă la intrarea în iarnă, crapul în vârstă de o vară, cu greutatea de peste 20 g, ar trebui să aibă un coeficient de îngrășare (K) mai mare de 1,6, cel cu greutatea între 15-20 g, K > 1,7, iar cel cu greutatea între 10-15 g,K> 2,0 (8,9). Toate cele trei rase de crap au prezentat la începutul perioadei de iarnă o stare de întreținere relativ bună, coeficientul de îngrășare variind între 2,50-3,14. Starea de întreținere a materialului piscicol la începutul și la sfârșitul perioa- dei de iarnă, este evidențiată și de compoziția chimică a corpului, în principal de nivelul glucidelor și lipidelor, principalele rezerve energetice ale organismelor animale. în faza anabolică a metabolismului (biosinteza) are loc depozitarea excesului de substanțe energogene sub formă de glicogen, trigliceride și proteine, rezerve ce vor fi mobilizate gradual în funcție de durata și intensitatea solicitărilor orga- nismului. Conținutul în grăsime este un indicator biochimic important, care permite aprecierea stării corporale și capacitatea de iemare a crapului. Este cunoscut faptul că în lunile de toamnă, odată cu scăderea temperaturii, are loc o diminuare a creșterii în lungime, dar și o intensificare a creșterii în greu- tate a peștelui, pentru acumularea de grăsime. Acumularea de grăsime în toamnă este consecința ritmului sezonier al metabolismului, în scopul pregătirii fiziologi- ce a peștelui pentru iernat (1, 10). Dinamica conținutului în grăsime al peștelui se află sub un control exogen, factorii trofici (cantitatea și calitatea hranei naturale și suplimentare) punându-și amprenta asupra nivelului substanțelor grase din corpul peștilor (8). Kostomarov indica pentru o bună supraviețuire a crapului în timpul iernii un conținut total în grăsime de cel puțin 3,5%, Havelka recomandând un conținut minim de 4% (5). Pierderile de grăsime cele mai mari (tab. 2), datorate condițiilor de iernare, au fost observate la exemplarele de crap care aparțin raselor Frăsinet și Ropsa (55,24%, respectiv 33,35%), rase care la începutul perioadei de iernare prezentau un conținut mediu de grăsime mai mare de 4%. Tabelul nr. 2 Pierderile în greutate și grăsime înregistrate la sfârșitul perioadei de iarnă la puietul de crap care aparține raselor Frăsinet, Ineu și Ropsa. RASA FRĂSINET INEU ROPSA SCĂZĂMÂNT ÎN GREUTATE (%) 20,47 14,74 17,54 SCĂZĂMÂNT ÎN GRĂSIME (%) 55,24 15,43 35,35 După epuizarea rezervei de lipide, următoarea rezervă energetică a organismu- lui ce este atacată o reprezintă proteinele. Conținutul în proteine al corpului peștilor este dependent de stadiul ciclului de viață și dimensiunile peștilor, creșterea % a proteinelor fiind consecința multiplicării numărului de celule și creșterii dimensiuni- lor celor existente (13), nivelul proteinelor aflându-se sub un control endogen (3). Cantitatea de proteine (%) conținută în corpul ciprinidelor este cuprinsă în general în intervalul 15-19%, o scădere drastică a proteinelor sub pragul de 15% 170 Alice-Vasile Șerbănescu et al. 6 prejudiciind starea fiziologică generală organismului, un consum intens al acesto- ra și pe o perioadă îndelungată poate conduce la moartea organismului (3,9). La începutul perioadei de iernat, nivelul cel mai scăzut al proteinelor a fost observat la puietul de crap care aparține rasei Ineu (15,18%), crapul Frăsinet caracterizându-se prin procentul cel mai ridicat de proteină brută (16,37%). La sfârșitul iemării, toate cele trei rase de crap se caracterizează printr-un conținut în proteină situat sub 15%. De semnalat este faptul că, deși rezerva de grăsime a organismului nu a fost complet epuizată, s-a recurs la consumul protei- nelor corpului pentru furnizarea energiei metabolice necesare întreținerii organis- mului în perioada de iarnă. Consumul cel mai intens de proteine a fost observat la puietul de crap din rasele Frăsinet și Ropsa, rase la care au fost înregistrate și cele mai mari pierderi în greutate. Cantitatea de apă conținută în corpul peștilor variază în raport invers proporțional cu nivelul lipidelor (6), la sfârșitul sezonului de iernat cantitatea de apă din corpul puietului de crap ce face obiectul acestui studiu atingând un nivel superior celui înregistrat la începutul acestei perioade. în strânsa corelație cu consumul grăsimii (lipidele totale), cea mai mare can- titate de apă acumulată în timpul iernii a fost observată la crapul Frăsinet (de la 77,11% toamna la 80,24% primăvara), nivelul apei din corpul crapului Ineu (exem- plarele din această rasă prezentau toamna conținutul în apă cel mai ridicat) a înre- gistrat în timpul iernii doar o ușoară creștere (de la 79,66% toamna la 80,79% primăvara). , Substanța minerală (cenușa) conținută în carnea peștelui relevă bogăția în săruri minerale a hranei ingerate (5,7). Corespunzător celor trei rase de crap luate în studiu, substanța minerală conținută în corpul peștilor a înregistrat pe parcursul perioadei de iemare o ușoară creștere comparativ cu valorile înregistrate toamna. Scăderea în greutate înregistrată la sfârșitul iemării (tab. 2) a depășit nivelul de 8% considerat normal pentru puiet (9), cele mai mari pierderi în greutate constatându-se la puietul din rasele Frăsinet și Ropsa, rase care la începutul ierna- tului prezentau greutățile medii cele mai mici. CONCLUZII Valorile coeficientului de condiție (Fulton), înregistrate ia începutul ier- nării, au indicat o stare de întreținere bună a puietului care aparține celor trei rase de crap; Scăderea în greutate înregistrată ia cele trei rase de crap luate în studiu a depășit nivelul normal pentru puiet, pierderile cele mai accentuate înregistrându-se la rasele Frăsinet și Ropsa; 7 Compoziția chimică a corpului la crap 171 Puietul de crap ce aparține raselor Frăsinet și Ropsa este caracterizat la înce- putul perioadei de iama prin greutăți medii situate sub greutatea optimă unei ier- nări în bune condiții; crapul care aparține rasei Ineu prezenta la începutul iemării o greutate optimă unei iemări în bune condiții; La puietul de crap Ineu, la începutul iemării, nivelele principalelor rezerv.e energetice ale organismului, erau inferioare celor înregistrate la rasele Frăsinet și Ropsa; pierderile de grăsime înregistrate la această rasă la sfârșitul perioadei de iarnă fiind situate sub cele constatate la rasele Frăsinet și Ropsa; La toate cele trei rase de crap, puietul a trecut la utilizarea proteinelor corpu- lui pentru procurarea energiei metabolice necesară întreținerii organismului în pe- rioada de iarnă, deși rezerva de grăsime nu a fost complet epuizată; Consumul cel mai intens de proteine a fost observat la rasele Frăsinet și Rop- sa, rase Ia care s-au înregistrat și cele mai mari scăzăminte în greutate; Dintre cele trei rase de crap investigate, puietul de crap ce aparține rasei Ineu, singurul care a avut talia normală, a rezistat mai bine la condițiile de viață oferite în timpul iernii. BIBLIOGRAFIE 1. BOTTESCH A., Variații cantitative și calitative ale grăsimii crapului de cultură în timpul unui an, Buletinul Inst. Cerc. Pisc., 3: 45-54, 1958. 2. DUMITRU I.F., Lucrări practice de biochimie, Edit. Didactică și Pedagogică, București, 1967. 3. . FAUCONEAU B„ ALAMI H.-DURANTE, LAROCHE M., Growth and meat quality relations in carp, Aquaculture (special issue), 129: 265-297, 1995. 4. GERIS G., POLI B.M., GUALTIERIM., LUPI P., PARISIG., Body traits andrearing environ- ment, Aquaculture (special issue), 129: 329-333, 1995. 5. GHERACOPOL O., Observații asupra modificării unor indici morfologici și biochimici la cra- pul de cultură, în perioada de iarnă, Studii și cercetări piscicole, 4(7): 253-271,1971. 6. HERZBERG A., PASTEUR R., Proximate composition andpreliminary data on freshness de- termination ofsilvercarp (H. Molitrix), The Israeli Journal of Aquaculture - Bamid- geh, 33(3): 87-99, 1981. 7. HURGHIȘIU L, MARINESCU Al.G., Compoziția chimică organică și anorganică la două specii de pești (crap și caras) sub influența regimului de hrană și a inaniției, Natura- lia, St. cerc., 1:211-216, 1995. 8. JOBLIN M., RANKIN C., JENSEN B„ Bioenergetics,feed intake and energy partitioning, Fish Ecophysiology, London, 1993. 9. LOVE R.M., The Chemical biology offishes, Academic Press, London, 1970. 10. MARINESCU Al.G., O. DRĂGHICI, C.A. PICOȘ, Cercetări de ecofiziologie experimentală privind influența factorului termic și nutritiv asupra metabolismului energetic și ma- terial al peștilor, Bul. Șt. Univ. Pitești, 5-36, 1994. 172’ . Alice-Vasile Serbănescu et al. 8 11. NICOLAU A., LUSCAN S., Observații privind scăzământul în greutate la crapul de cultură de doi ani în timpul iernii. Buletinul Institutului de cercetări piscicole, 4: 51-56,1956. 12. POJOGAI., Piscicultura, Edit. Ceres, 1977. 13. SHEARER K.D., Factors affecting the proximate compoșitidn ofculturedfishes with emphasis on salmonids, Aquaculture, 119: 63-88, 1994. 14. STEFFENS W., Grundlagen der Fischemăhnung, Gustav-Fischer Verlag, Jena, 1985. Primit în redacție la 10 iunie 1997. Stațiunea de Cercetări pentru Piscicultură Nucet, 0230 Nucet, jud, Dămbovițâ. CERCETĂRI PRIVIND COMPORTAMENTUL ÎN CÂMP A MASCULILOR DE Ostrinia nubilalis Hb. MARC AȚI I. ROȘCA*, AL. BĂRBULESCU** This paper presents the results registered during 1993-1996 period, regarding the behavior of E.C.B. males, marked with Calco red dye and released in field conditions and recaptured in pheromone traps situated on the N-S and E-W axes, at different distances from the releasing point. On the basis of this experiment, it has been possible to demonstrate that male moths are flying not more than 3,000 m from the releasing point, being possible to estimate the popu- lation of pest. Sfredelitorul porumbului (Ostrinia nubilalis Hb.) este unul din cei mai importanți dăunători ai porumbului, atât în lume cât și în România. In țara noastră, sfredelitorul porumbului este întâlnit în toate zonele de cultură a porumbului și produce cele mai mari pagube după apariția paniculelor. Pagubele provocate pot atinge 40% din recolta de boabe (4), dar în mod obișnuit se înregistrează, cu variații mai mari, sau mai mici în funcție de an și zonă, în medie 44 % plante atacate, 1.1 larve/plantă, 23180 larve/ha și 550 kg/ha (sau 7,5 %), pierderi de recoltă (5). în scopul dezvoltării în Romania a cercetărilor legate de tehnicile lansării de insecte sterile pentru combaterea dăunătorilor (6-8), având drept model sfredeli- torul porumbului (Ostrinia nubilalis Hb.), o atenție specială a fost acordată, stu- diului dinamicii și estimării populațiilor naturale a fluturilor de sfredelitorul porumbului, cu ajutorul capcanelor feromonale, iar începând din 1993, cu ajutorul lansării de fluturi marcați cu „Calco red dye” și recapturării acestora în capcane feromonale. Capacitatea și abilitatea insectelor de a parcurge prin zbor, sau utilizând curenții de aer favorabili, distanțe cât mai mari, este un mecanism care asigură supraviețuirea cu succes a speciei în ansamblu, de aceea informațiile legate de capacitatea de zbor a sfredelitorului porumbului și cunoașterea modelului de dis- persie a dăunătorului a constituit obiectivul major al cercetărilor întreprinse. MATERIAL ȘI METODĂ S-a utilizat feromonul sintetic varianta CIS (E-5) și varianta TRANS (I) pentru studiul ciclului biologic al dăunătorului în cursul anilor 1990-1996, și nu- St. cerc, biol., Seria biol, anim., t. 49, nr. 2, p. 173-178, București, 1997 174 I. Roșea et al. 2 Comportamentul sfredelitorului porumbului în câmp 175 mai varianta CIS pentu studiile legate de lansarea de masculi marcați și recaptura- rea masculilor. Capcanele feromonale au fost instalate în perioada iunie-septem- brie, la 1 m deasupra solului, la 50 m una de alta în culturile de porumb. Pentru studierea biologiei dăunătorului, momelile au fost schimbate la două săptămâni, iar părțile adezive, ori de câte ori a fost necesar. Pentru studiul dispersiei dăunăto- rului, masculii marcați au fost lansați în perioadele în care populația dăunătorului era scăzută. Cercetările preliminare de marcare a adulților cu fucsină, sau cu vopsea flu- orescentă, sau contaminarea hranei cu P32, nu au dat rezultatele scontate în experiențele de câmp sau laborator și de aceea au fost abandonate. Cercetările prezentate au utilizat ca metodă de marcare, colorarea hranei pe care este crescut dăunătorul cu „Calco red dye” (11). în prezent, în cercetările privind comporta- mentul și modul de zbor al sfredelitorului porumbului, metoda de marcare utilizează un amestec de Calco red dye N-1700 (150 mg/kg de dietă (0,015%) și ulei de floarea soarelui 5 ml/kg). Colorantul utilizat în dieta în care are loc creșterea larve- lor de sfredelitorul porumbului marchează indubitabil toți adulții, astfel că ei pot fi recunoscuți cu ușurință în câmp prin examinarea vizuală a spațiilor fine dintre segmentele abdominale, sau prin strivirea abdomenului, astfel încât, conținutul acestuia, de culoare roșie, poate fi evidențiat. în cazuri cu totul speciale, adulții marcați au putut fi identificați prin moj ararea lor într-o cantitate mică de acetonă, trecând extractul prin hârtie de filtru. Pentru creșterea în masă a dăunătorului și marcarea acestuia, s-a folosit pro- cedura standard utilizată în laboratorul de protecție a plantelor de la Fundulea (1). Cercetările anterioare, au arătat că există posibilitatea de a utiliza capcanele fero- monale de tip Fundulea-1 și feromoni sexuali de sinteză pentru a captura masculii speciei Ostrinia nubilalis Hb. (9,10), de aceea ei au fost utilizați pentru capturarea masculilor marcați cu Calco red adăugat în mediul de creștere a larvelor, în scopul marcării adulților. Masculii marcați au fost crescuți în laborator, lansați în câmp și recapturați în capcane feromonale situate la diferite distanțe de locul de lansare, în direcția celor 4 puncte cardinale (N, S, E și V). Capcanele au fost instalate la 25,100 și 200 m în 1993, la 100, 200 și 300 m în 1994, la 300, 600, 900, 1200 și 1500 m în 1995 și la 1000, 2000, 3000,4000 și 5000 m în 1996. REZULTATE ȘI DISCUȚII Rezultatele prezentate în tabelul 1, demonstrează faptul că, în zona Fundulea majoritatea populației de sfredelitorul porumbului este alcătuită din ferotipul CIS (E-5), populația TRANS (I), este mică. Numărul capturilor speciei țintă diferă în funcție de an și varianta feromonală utilizată. Perioada de zbor a speciei Ostrinia nubilalis, monitorizată cu ajutorul capca- nelor feromonale, este prezentată în tabelul 2. Tabelul nr. 1 Numărul de masculi de Ostrinia nubilalis Hb. capturați/capcană/an - FUNDULEA Pherotype 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 E 1,75 1,25 0,75 2,75 L5 0,5 0 Z 8,25 14,75 23,25 29,5 35,25 17,2 10,5 Tabelul nr. 2 Evoluția numărului de masculi capturați/capcană - FUNDULEA DATA 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 17-23 V 0 0 0 0 0 0 0 24-30 V 0 0 0,75 0 0,5 0 0 31 V-6 VI 0 0,25 0,25 0,5 0,5 0 0 7-13 VI 2,5 0,75 0,5 1 0 0 0,75 14-20 VI 0,5 1,5 3,25 2 1 0,5 3,5 21-27 VI 1 2,25 6,5 6 1,5 3,25 2,5 28 VI-4 VII 0,5 3,25 3,25 7 4 4 1,25 5-11 VII 1 1,5 2,25 4,5 10,5 0,75 0,25 12-18 VII 0 0,25 1,5 0 7 0,25 0 19-25 VII 0 0,25 0,25 0,5 2,5 0 0 26 VII-1 VIII 0 0 0,25 0,5 0,5 0 0 2-8 VIII 0 0,25 0,5 2,5 0 0 0,5 9-15 VIII 0,5 0,25 0 3,5 0,5 5,5 1,25 16-22 VIII 0,75 0,75 0,25 1 1,5 2,25 0,25 23-29 VIII 1,25 1,75 1,25 0 3,75 0,75 0,25 30 VIII-5IX 0,25 1,25 2,25 0,5 1,5 0 o 6-12IX 0 0,5 0,25 0 0 0 0 TOTAL 8,25 14,75 23,25 29,5 35,25 17,25 10,5 ^Rezultatele noastre evidențiază faptul că, majoritatea capturilor s-au înregis- trat în cursul primei generații, generația a doua este formată din mai puțini indivizi, cel puțin în culturile de porumb unde capcanele feromonale au fost instalate și ea apare la sfârșitul lunii august, începutul lunii septembrie, neavând practic nici o importanță pentru cultura porumbului care este trecut de faza de maturizare (tab. 3). Distanța la care o insectă zboară atunci când se răspândește în natură este deosebit de importantă, iar despre aceasta, în cazul speciei Ostrinia nubilalis Hb., părerile sunt diferite. în anul 1969, Jermy și Nagy (3) consideră că în natură adulții pot migra pe distanțe lungi, dar cercetările anterioare întreprinse, pentru prima dată în România, indică faptul că adulții dăunătorului nu sunt zburători de 176 I. Roșea et al. 4 Comportamentul sfredelitorului porumbului în câmp 177 performanță, dispersia lor se face cu 300 m/zi, depinzând însă puternic de condițiile meteorologice, în special de direcția vântului. Experiențele realizate în cursul ani- lor 1993 -1996, de lansare și recapturare a masculilor marcați, au arătat că în condițiile locale de la Fundulea, procentul de recapturare a fost de 5,9% în 1993, 3,9% în 1994,0,2% în 1995 și 0,3% în 1996. Testele din 1995 și 1996 au arătat că masculii nu pot zbura mai mult de 3000 m de la punctul de lansare (fig. 1). Tabelul nr. 3 Numărul de masculi de Ostrinia nubilalis Hb., capturați/capcană/an și mărimea celor două generații - FUNDULEA 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 TOTAL 8,25 14,75 23,25 29,5 35,25 17,25 10,5 Generația I 5,5 10 19,25 21 28 8,75 8,25 Generația a Il-a 2,75 4,75 4 8,5 7,25 8,5 2,25 Fig. 1 - Comportarea sfredelitorului (Ostrinia nubilalis Hb.) Ca o concluzie preliminară din examinarea datelor prezentate, se poate afir- ma că, în condițiile experimentale date, un adult poate zbura cel mult 300 m/zi. în general, zborul adulților marcați a fost puternic influențat de direcția vântului. Astfel, în 1993, fluturii marcați au fost lansati pe 11 iunie în câmp, cu 10 zile înainte de apariția naturală a zborului dăunătorului. în zilele de 12-14 vântul a suflat în direcția sud-est, nord-vest, iar toate capturile au fost în această direcție, față de punctul de lansare. în zilele următoare, direcția vântului s-a schimbat cu 180 de grade, iar adulții marcați au fost purtați de vânt într-o nouă direcție, sud-est. O situație similară se înregistrează și în cursul anilor 1994-1996, modificările direcției vântului determinând o altă caracteristică, variabilă, a dispersiei în natură a masculilor marcați. Cercetările de câmp efectuate prin folosirea tehnicii de lansare-recapturare a masculilor marcați permit investigarea posibilităților de dispersie pe distanțe lungi, confirmând rezultatele obținute cu o altă specie similară. Astfel, în China cerce- tările efectuate de Wang și colab. în perioada 1987-1988 și reluate în 1991-1992 (comunicare personală), au demonstrat că Ostrinia furnacalis Guenee, dăunătorul similar din China pentru porumb, deși poate zbura până la 45,5 km distanță de locul de lansare, peste 93% din masculii marcați recapturați sunt dispersați în inte- riorul unei arii de dispersie cu raza de 2 km. Metoda creșterii și lansării de insecte marcate, în populații naturale și recap- turarea atât a insectelor naturale cât și a celor marcate, oferă posibilitatea de a determina mărimea unei populații la un anumit moment, prin aplicarea formulei N XN lui JENKINS (2): Pt = —31------L, în care Pt = populația totală, Nm = numărul de Nmr insecte marcate și lansate în natură, Nr = numărul total de insecte capturate și Nmr = numărul de insecte marcate și recapturate. Aplicând această formulă, pe baza numărului de masculi de Ostrinia nubilalis marcați și lansați, și pe baza numărului de masculi marcați și nemarcați, capturați în capcane feromonale, s-a determinat populația dăunătorului în condiții experimentale date. Datele obținute sunt prezentate în tabelul 4, unde se remarcă faptul că densi- tatea estimată a dăunătorului pe suprafețe relativ mari, poate fi apreciată cu ajuto- rul acestei metode.. Tabelul nr. 4 Estimarea populației de Ostrinia nubilalis Hb. prin metoda lansării și recapturării de masculi marcați cu „Calco red dye” Data lansării Nr. masculi marcați lansați Nr. masculi marcați recapturați Total masculi capturați Suprafața urmărită (ha) Densitatea dăunătorului natura] (ha) 34 1 12 VI-1993 714 42 63 10,5 21 VI-1994 876 34 49 9,0 43,8 5 VIH-1995 15132 35 45 225 13,22 21 VII-1996 16125 41 42 2500 1,36 CONCLUZII în condițiile experimentale date un mascul adult poate zbura cel mult 300 m/zi, până la 3000 m și în general zborul adulților marcați a fost puternic influențat de direcția vântului. 178 I. Roșea et al. 6 Din numărul total de masculi capturați în capcane feromonale, cei aparținând generației a doua sunt mai puțini. Utilizarea formulei lui Jenkins, oferă posibilitatea de a determina mărimea populației sfredelitorului porumbului într-o anumită perioadă și pe o anumită suprafață. BIBLIOGRAFIE 1. BĂRBULESCU Al., ROȘCA I., Possibilities of usihg radiation-induced F-l sterility for con- trol of European eoni borer in Romania. The Third FAO/1AEA Proceedings of the final research coordination meeting on “Radiation-induced F-l Sterility in Lepidop- tera for Area-Wide Control”, Phoenix, Arizona, September 9-13, 1991, 1993. 2. JENKINS D.W., Radioisotopes in entomological studies of endemic and tropical diseases, în: Radioisotopes in tropical medicine (Proc. Symp. Bangkok, 1960), IAEA, Vienna, 235-266, 1962. 3. JERMY L, NAGY J., Sterile-male technique studies in Hungary. Sterile-male technique for eradication or control ofhannful insects, Proceedings of a panel, Vienna, May 27-31. 1968, 91-95, 1969. 4. PAULIAN F. și colab.. O contribuție la cunoașterea biologiei și combaterii sfredelitorului po- rumbului (Pyrausta nubilalis Hb.), An. I.C.C.A., Ser. B, 29: 397-420, 1961. 5. PAULIAN F. și colab., Evoluția sfredelitorului european al porumbului (Ostrinia nubilalis Hb.) și potențialul de dăunare înregistrat între 1971-1975, Prob. Prot. Plant., 6(1): 23-48, 1976. 6. ROȘCA I., BĂRBULESCU AL, Gamina radiation sterilisation of Ostrinia nubilalis Hb., an important pest of maize crops in Romania, Rev. Roumaine de Biologie, 34(2): 107-111. 1989. 7. ROȘCA I., BĂRBULESCU AL, Sterility’ inheritance in the irradiated European corn borer, Ostrinia nubilalis Hb., Rev. Roumaine de Biologie, 35(1): 27-30, 1990. 8. ROȘCA I., BĂRBULESCU AL. Evaluation of the potențial control of the European corn borer (Ostrinia nubilalis Hb.) in the field by radiation-induced F-l sterility, Proceedings on the International Symposium on Management of Insect Pests: Nuclear and Related Molecular and Genetic Techniques, Vienna, October 19-23, 1992, 379-394, 1993. 9. ROȘCA I. et al., Researches on the behaviour of Ostrinia nubilalis by the use of pheromone traps as related to sterile insect release technique, Rev. Roumaine de Biologie, 35(2): 105.-115, 1990. 10. ROȘCA L, et al., Achievements and perspectives in the use of sex pheromone in cereai and technical crops in Romania, Proc. Conf. Insect. Chem. EcoL, Tabor 1990, SPB Acad. PubL, The Hague, 373-388, 1991. 11. ROȘCA I. și colab.. Marcarea și urmărirea dispersiei sfredelitorului european al porumbului (Ostrinia nubilalis Hb.). Lucrările celei de a treia Conf. Naț. pentru Prot. Mediului prin Mijloace Biologice și Biotehnice, 177-182, 1996. Primit în redacție la 30 mai 1997. * Universitatea de Științe Agronomice și Medicină Veterinară, Facultatea de Agricultură, București. ** Institutul de Cercetări pentru Cereale și Plante Tehnice - Fundulea. MATURAREA OVOCITELOR LA TELEOSTEENI ANDREA CRISTINA STAICU, RADU MEȘTER Fish postvitellogenetic oocytes are arrested at the first meiosis prophase, exactly at the border Gf M phases. Pituitary gonadotropin is the signal triggering the meiotic maturation. GnRH released under the environmental pressure checks gonadotropin level. Gonadotropin is recog- nized by specific membrane receptors from thecal cells and granulosa cells and triggers an intracellular signalizing mechanism involving G proteins, adenylil cyclase and AMPc. The interaction betwecn the two follicular layers causes the synthesis of the maturation inducing hormone (M1H). MIH, opposed to the manner of steroid hormone action, recognizes a surface membrane receptor. MIH effects are mediated in oocyte by a cytoplasmic factor, maturation . promoting factor (MPF). MPF is a complex that contains a serin/treoninkinase (cdc2), and a cyclin. It becomes active through the phosphorilation of a ede 2Thr residue (Thr 161) and a cyclin Ser residue. MPF influences the structural and biochemical events of maturation. The oocyte ends its first meiotic division and begins the second one arresting it at the second mctaphase until a spermatozoon meets the oocyte. The second metaphase arrest is determined by CSF, a cytoplasmic factor, codified by a protooncogene, c-mos. CSF is destroyed at the moment of spermatozoon penetration. Studiul ovogenezei face în continuare obiectul preocupării multor echipe de cercetători. Una dintre etapele care a captat interesul științific al ultimilor ani este maturarea ovocitului, moment decisiv în controlul ciclului celular meiotic, de care depinde succesul fertilizării. Ovocitele peștilor sunt oprite, în mod fiziologic, la limita G2/M a primei profaze meiotice. Pentru ca ovocitele să fie fertilizate ele trebuie să finalizeze pri- ma diviziune meiotică, declanșată de o stimulare hormonală adecvată și să înceapă a doua diviziune meiotică. Meioza va fi din nou oprită în metafaza a doua. Blocajul este înlăturat în momentul fertilizării, după penetrarea spermatozoidului, când are loc formarea celui 'de-al doilea globul polar. Intervalul de timp cuprins între momentul reluării meiozei și a doua metafa- ză meiotică se numește maturare meiotică. Este o etapă care se derulează cu mare rapiditate (aproximativ 24 de ore) și este controlată de o serie de reglatori majori, dintre care amintim: gonadotropina, hormonul care induce maturarea și factorul promotor al maturării. St. cerc: biol., Seria biol, anim., t. 49, nr. 2, p. 179-197, București, 1997 180 Andrea Cristina Staicu et al. 2 3 Maturarea ovocitelor la Teleosteeni 181 STRUCTURA FOLICULILOR OVARIENI LA TELEOSTEENI Ovocitele vitelogenetice ale teleosteenilor sunt înconjurate, în întregime, de stratul folicular diferențiat în două categorii de celule: celulele tecale și celulele granuloasei. învelișul tecal mai conține fibroblaste, capilare, fibre de colagen, celule glan- dulare mari, denumite și celule tecale speciale. Acestea din urmă posedă mitocon- drii cu criste tubulare, reticul endoplasmatic tubular agranular, caractere care le apropie de celulele steroidogenetice (55). Granuloasa este alcătuită dintr-o populație omogenă de celule care conțin enzimele steroidogenetice. în timpul maturării ovocitului aceste celule suferă alte- rări citologice din care se pot aminti: proliferarea aparatului Golgi, însoțită de acumulare de material secretor, creșterea numărului cisternelor reticulului endo- plasmatic granular, uneori bogat în material amorf intracistemal, care se concen- trează în spațiul dintre lamele (79). GONADOTROPINA: MEDIATORUL PRIMAR AL MATURĂRII OVOCITULUI HORMONUL DE ELIBERARE AL GONADOTROPINEI S-a demonstrat că la peștii osoși neuronii implicați în elaborarea hormonului de eliberare al gonadotropinei sunt asociați nervului terminal (54, 64, 15, 30). Neuronii pornesc din afara creierului, trec din cavitatea nazală prin placa cribifor- mă în, creierul anterior. La Clarias batrachus anumiți neuroni GnRH rămân în epiteliul olfactiv, la Carassius auratus, Salmo trutta, Oncorhynchus masou, neu- ronii GnRH sunt identificați la extremitatea anterioară, ca nervi olfactivi (41, 8), dar la multe specii de teleosteeni acești neuroni se găsesc la limita dintre nervul olfactiv și bulb sau la nivelul bulbului olfactiv anterior (84, 70, 2). La Xiphophorus maculatus, Lepomis macrochirus, Dicentrarchus labrax, Solea solea, Clarias batrachus, Poecilia latipina, Poecilia reticulata apar corpuri celulare în nuleul olfactoretinalis, la joncțiunea bulbilor olfactivi cu telencefalul ventral. La teleosteeni neuronii GnRH există aproape întotdeauna în telencefal, pe partea ventrală sau în ariile preoptice, uneori în diencefal, sau în nucleul lateral tuberal. Axonii se întind de la neuronii preoptici sau hipotalamici, în hipofiza an- terioară și uneori în neurohipofiză, ventriculul III și zonele creierului din afara hipotalamusului. Majoritatea teleosteenilor, cu excepția unor specii primitive, sunt lipsite de un sistem sanguin portal necesar transportului GnRH. La salmonide apar două tipuri de GnRH dintre care doar sGnRH reglează sinteza și eliberarea de GTH. La Oncorhynchus masou s-a remarcat o creștere a nivelului sGnRH din telencefal în cursul maturării gonadei. Se poate afirma deci că, neuronii din telencefal (aria preoptică și partea ventrală a telencefalului) sunt implicați în maturarea gonadei, având nivele ridicate de ARNm care codifică sGnRH. Amano, formulează ipoteza că acești neuroni ar putea să inerveze hipo- fiza și să regleze secreția de GTH. Același autor demonstrează că, expresia genei sGnRH a putut fi reglată prin manipularea fotoperioadei; o scădere a fotoperioadei a accelerat activitatea sintetică a sGnRH, în timp ce o fotoperioadă lungă a inhibat activitatea sa. Eliberarea GnRH din neuronii hipotalamici este influențată de factori externi și interni, care acționează pe căi nervoase centrale. Răspunsul biochimic la acțiunea GnRH este un proces complex de semnali- zare, care determină o creștere a tum-over-ului fosfoinositolului, o creștere a concentrației Ca2+ intracelular, activarea protein-kinazei C, (12, 62, 10), modifi- carea nivelului AMPc (11). Există două secvențe de ADN care ar putea media efectul GnRH asupra ge- nei care codifică subunitatea a a hormonului glicoproteic: GCTAATTA; TT(C/T)CT(A/C/T)(C/T). CARACTERIZAREA GONADOTROPINEI LA PEȘTII OSOȘI La Oncorhynchus keta au fost identificate două gonadotropine distincte din categoria hidraților de carbon: GTH I, GTH II. Acestea sunt diferite una de cealal- tă în trăsăturile lor chimice și structurale, dar omoloage hormonului folicular sti- mulator (FSH) și hormonului luteinizant (LH) al tetrapodelor. Fiecare gonadotropină constă din subunități oc (113 aminoacizi) și p (119 ami- noacizi), subunitățile P având o identitate a secvenței de aminoacizi de 31%. Ni- velele celor două gonadotropine variază semnificativ în timpul dezvoltării reproductive. GTH I (oc, IP) este gonadotropina predominantă în plasma și hipofiza feme- lelor vitelogenetice și crește pe parcursul gametogenezei. Ea promovează producția de 17p-estradiol la femelă și de 11-ketotestosteron, la mascul, precum și încorpo- rarea vitelogeninului în ovocite. Aceste observații sugerează că GTH I reglează gametogeneza. GTH II (a, lip) înregistrează nivele ridicate în momentul maturării finale a ovocitului, fiind o gonadotropina mai activă decât GTH I în stimularea secreției de 17a, 20P, dihidroxi-4-pregnen-3-onă în ovocitele postvitelogenetice și a 17a-hidroxiprogesteronului în stratul tecal. GTH II stimulează maturarea gârneților și este implicată în procesul de ovulație și spermiație. Ovocitele femelelor pot fi stimulate să se matureze și să ovuleze prin admi- nistrarea unei varietăți de preparate gonadotropinice. Ovocitele denudate sunt însă incapabile să răspundă la gonadotropină, ceea ce conduce la ideea că acțiunea gonadotropinei, în inducerea maturării ovocitului, este dependentă de sinteza unui mediator steroidal secundar al maturării meiotice (83, 50, 57, 38). Secreția de gonadotropină este controlată și de anumite substanțe nesteroide din gonade. Extractele obținute din ovarele și testiculele de caras au avut efecte 182 Andrea Cristina Staicu et al. 4 Maturarea ovocitelor Ia Teleosteeni 183 stimulatoare asupra eliberării GTHII hipofizare. Acțiunea stimulatoare s-a modi- ficat în funcție de stadiul de dezvoltare al ovarului. Inhibina și activina, din fluidul folicular porcin, au acțiuni stimulatoare asu- pra eliberării GTH H de caras (24). , Insulina sporește acțiunile stimulatoare ale gonadoțropinei asupra producției de AMPc și testosteron din foliculii prematuraționali, favorizează conversia 25-hidroxicolesterolului în testosteron, acționând prin intermediul AMPc, în mo- bilizarea colesterolului la nivelul mitocondriei (53, 75). HORMONUL INDUCTOR AL MATURĂRII: MEDIATORUL SECUNDAR AL MATURĂRII OVOCITULUI Pentru inducerea maturării în ovocitele teleosteenilor au fost testați mai mulți steroizi C21: progesteron, 17a-hidroxiprogesteron, 17a, 20(3-2 Itrihidro- xi-4-pregnen-3-onă, cortizol, deoxicorticosteron. Dintre ei, doar doi, 17a,20(3-21 trihidroxi-4-pregnen-3-onă și 17a, 20(3 dihidroxi-4-pregnen-3-onă acționează în mod natural, ca hormoni inductori ai maturării, iar 17a, 20(3 dihidroxi-4-preg- nen-3-onă a fost cel mai eficient. Imediat după formarea sa, acesta este transfor- mat într-un metabolit mai puțin activ din punct de vedere biologic, 17a, 20(3 dihidroxi 5(3 pregnan-3-onă. MODELUL BICELULAR AL SINTEZEI HORMONULUI INDUCTOR AL MATURĂRII Young și Nagahama propun modelul bicelular al producerii foliculare de MIH, conform căruia situsul primar al producerii de MIH este stratul folicular, care înconjoară ovocitul. Young subliniază faptul că ambele staturi sunt necesare pentru producerea 17a, 2O(3-DP. Conform acestui model, stratul tecal produce un precursor steroid, 17 a-P care traversează membrana bazală și este transformat în 17a, 20(3 dihidro- xi-4-pregnen-3-onă la nivelul granuloasei, unde gonadotropina acționează prin sti- mularea activității 20(3-hidroxisteroiddehidrogenazei, enzimă care catalizează conversia 17a-P în 17a, 20(3 dihidroxi-4-pregnen-3-onă (fig. 1). La Fundulus heteroclitus producția del7a, 20(3 dihidroxi-4-pregnen-3-onă nu cere participarea celor două tipuri celulare. în cursul vitelogenezei, sub influența gonadoțropinei, stratul tecal secretă un hormon androgen, probabil testosteron, care traversează lamina bazală și este con- vertit în 17(3-estradiol, la nivelul granuloasei unde este exclusiv localizată enzima cheie a conversiei testosteronului în 17{3-estradiol, aromataza (40, 58). Capacita- tea stratului tecal de a produce testosteron, ca răspuns la gonadotropina, crește gradat în cursul dezvoltării ovocitului și ajunge la un nivel maxim, în perioada postvitelogenetică. Activitatea aromatazei în stratul celulei granuloase a crescut în Gonadotropina Receptor GTH CELULA TECALĂ---------------------—---------------- Cholesterol | P-450scc £> ---?-----cAMP Pregnenolon 3&-HSD Progesteron . P-45o17a £> 17a - Hidroxlprogesteron Fig. 1 - Modelul bicelular al producerii 17a, 20P-dihidroxi-4-pregnen-3-ona în foliculii postvitelo- genetici. Nagahama Y., 1994. timpul vitelogenezei și a scăzut rapid, în asociație cu maturarea ovocitului, ca răspuns la gonadotropina (89,43). Se pare că scăderea activității 17,20 liazei și/sau 17(3 hidroxisteroiddehidrogenazei din celulele tecale și creșterea activității 20a hidroxisteroiddehidrogenazei în celulele granuloasei par a fi cei doi factori majori responsabili pentru creșterea producției de 17a, 20(3 dihidroxi-4-pregnen-3-onă, realizată de foliculii intacți în timpul maturării ovocitului. Gonadotropina are cel puțin două situsuri de acțiune: stratul tecal și granuloasa, la nivelul cărora există receptori specifici pentru gonadotropi. Există cel puțin două tipuri de receptori de gonadotropină: receptori tip I, care leagă atât GTH I cât și GTH li, dar cu afinitate mai mare pentru GTH I și receptorul tip II, care leagă GTH II în mod specific și poate avea doar interacțiune limitată cu GTH I (87). Receptorul tip I există atât în stratul tecal cât și în celulele granuloase, în timp ce receptorul tip II există doar în celulele granuloasei. Numărul receptorilor pentru gonadotropină crește în ambele straturi în timpul ovogenezei (43). în stratul tecal producția de 17 a-P a crescut prin folosirea unor agenți care măresc concentrațiile intracelulare ale AMPc într-o manieră dependentă de doză (forskolin, dibutyryl AMPc) (43). Producția aceluiași hormon, indusă de gonado- tropină și AMPc, este abolită de cicloheximidă și puromicină, ceea ce sugerează 184 Andrea Cristina Staicu et al. 6 7 Maturarea ovocitelor Ia Teleosteeni 185 că efectul stimulator al gonadotropinei din stratul tecal necesită sinteza unei noi proteine (59). în membranele celulelor granuloase la Oncorhynchus rhodurus există pro- teine reglatoare care leagă nucleotide guaninice și adenilil ciclaza. Gonadotropina a stimulat activitatea 20 p HSD din celula granuloasă printr-o etapă mediată de receptor dar care antrenează și proteina G, adenilil ciclază, AMPc. Nivelul activității acestei enzime este controlat și de concentrația Ca2+, fapt dovedit prin experimentele efectuate în prezența ionoforului de calciu A23187, ester forbolului PMA, inhibito- rilor calmodulinei, trifuoroperazin, N, N-(6aminohexil) 1 naftalensulfonamidhi- droclorid și N-aminohexil-5-cloro-l-naftalensuifonamid (78). Experimentele prin care s-a încercat inhibarea sintezei de ARN, cu ajutorul actinomicinei D, cordyce- pinului, a amanitinei, sau s-a încercat blocarea sintezei proteice cu cicloheximidă și puromicină, au condus la diminuarea producției de 17a, 20p dihidroxi-4-preg- nen-3-onă. Concluzia care se desprinde este că, una dintre acțiunile majore prin care gonadotropina activează 20P-HSD în celulele granuloasei este creșterea ni- velului ARN și a sintezei proteice (56, 57) (fig. 2). 17a-Hidroxi- progesteron Sinteza ^OP-HSD ARNm 17a,20b-Dihidroxi 4-pregnen-3-ona MATURAREA OVOCITULUI Proteina G Fig. 2 - Mecanismul activării 20 hidroxisteroiddehidrogenezei în celulele granuloasei. RECEPTORII' HORMONULUI INDUCTOR AL MATURĂRII Spre deosebire de modul în care acționează majoritatea hormonilor steroizi și anume la nivelul receptorilor nucleari, hormonul inductor al maturării acționează la nivelul unui situs de suprafață, sau aproape de suprafață. Se presupune că modul de acțiune al hormonului inductor al maturării la pești este asemănător cu acela descris la stelele de mare și care implică proteinele G (76, 36). Traducerea semnalului prin receptorul 17a, 20P-dihidroxi-4-pregnen-3-onă este mediată de proteinele G inhibitorii, hormonul activând proteinele Gj (88). Hormonul inductor al maturării a inhibat activitatea adenilil-ciclazei în pre- paratele membranare rezultat semnalat și în anul 1981 (48). Această observație aduce dovada indirectă a faptului că se produce activarea proteinei Gj, ca urmare a stimulării cu 17a, 20p, dihidroxi-4-pregnen-3-onă și că are loc scăderea activității adenilil-ciclazei la nivelul membranelor ovocitelor, urmată de scăderea nivelului AMPc din celulă. Probabil că diminuarea concentrației AMPc reprezintă factorul care mediază acțiunea MIH în ovocitele peștilor (37, 19). FACTORUL DE PROMOVARE AL MATURĂRII, MEDIATORUL TERȚIAR AL MATURĂRII OVOCITULUI Existența receptorilor pentru hormonul inductor al maturării la suprafața ovo- citelor face necesară prezența unui factor citoplasmatic care trebuie să medieze acțiunea MIH și să declanșeze evenimentele morfologice ale maturării. Acest factor, denumit factor promotor al maturării (MPF) a fost pentru prima oară detectat în ovulele nefertilizate de amfibieni, din care a fost extrasă citoplas- mă și apoi microinjectată în ovocite blocate în profaza I a meiozei; în care el a stimulat maturarea (50). S-a presupus că și în ovocitele de pește este produs un factor citoplasmatic similar MPF de la amfibieni, sub influența 17a, 2O|3, dihidroxi-4-pregnen-3-onă. Activitatea MPF a fost caracterizată în ovocitele de caras, maturate cu gona- dotropină corionică umană in vivo. Activitatea MPF a oscilat în concordanță cu ciclul celular al ovocitelor. A crescut înainte de distrugerea veziculei germinative, a ajuns la maximum în prima metafază meiotică, apoi a descrescut temporar când a fost eliminat primul globul polar. A crescut din nou și a rămas la nivel înalt până la fertilizare (84) (fig. 3). MPF este un factor reglator al ciclului celular, identificat la toate eucariotele, atât în celulele somatice cât și în cele ale liniei germinale, la plante și animale (59, 45,21,22,47). MPF este alcătuit dintr-o subunitate catalitică, un omolog al serin/treonin kinazei (cdc 2), care folosește histona ca substrat (6) și o subunitate reglatoare, ciclina (22) (fig. 4). 186 Andrea Cristina Staicu et al. 8 9 Maturarea ovocitelor la Teleosteeni 187 Fig. 3 _ Creșterea și scăderea nivelelor MPF și ciclinei în cursul ciclului celular. kinaza dependenta de ciclină Cdc2 ' I___________ MPF Fig. 4 - Structura factorului promotor al maturării. Ciclina B nu este detectabilă în ovocitele imature de caras, acestea conțin doar cdc2 de 35kDa (42), fapt care sugerează că cdc2 kinaza se află într-o formă monomerică. Ciclina B urmează să fie sintetizată de novo brusc, chiar înaintea distrugerii veziculei germinative și formează un complex cu cdc 2 de 35 kDa (44). Activitatea MPF este controlată prin fosforilări și defosforilări ale cdc2 kina- zei, care se produc după legarea de ciclina B. Cdc2 kinaza inactivă (35 kDa), existentă în ovocitele imature de caras, este deja defosforilată la reziduurile Thr 14 și Tyr 15. Complexul se va activa după fosforilarea reziduului de Thrl61 al cdc2 (44, 86), în prezența unei treoninkinaze (p40 M015), numită și kinaza activatoare a cdc2 (73). Subunitatea catalitică a acestei enzime este MO15 (18, 65, 74). Activarea MPF coincide cu modificarea greutății moleculare de la 35 la 34 kDa. Un alt moment important al activării MPF, dar a cărui importanță este încă discutată, îl constituie fosforilarea unui reziduu de serină al moleculei de ciclină B. Prin înlăturarea situsurilor de fosforilare ale cdc2 (Ser79 și Ser94) a fost blocată fosforilarea serinei din molecula de ciclină B, dar nu a fost afectată activarea cdc2. Este foarte posibil ca fosforilarea serinei ciclinei B să fie catalizată chiar de cdc2, dar să nu fie necesară activării cdc2. Mecanismul activării MPF este, în linii generale, asemănător în toată lumea vie, are totuși anumite detalii specifice speciei. La Xenopus laevis, la diferite spe- cii de stele de mare se cunoaște faptul că ciclina B formează un complex cu cdc2 kinaza (pre-MPF) chiar în stadiul de ovocit imatur. O pondere deosebită în meca- nismul activării MPF revine stării de fosforilare a reziduului Tyr 15 al cdc2 kina- zei. în stare inactivă acest complex are cdc2 kinaza fosforilată la reziduurile Tyr 15 și Thr 161 de către enzirnele wee 1 respectiv MO 15. în cursul activării ovocitu- lui Thy 15 este defosforilată de către cdc25 fosfataza și dobândește activitate kina- zică pentru histona Hj (16, 17, 39, 35). Reziduul de Thr 161 rămâne fosforilat, producând MPF activ după ce a fost fosforilat și reziduul de Ser94 sau Ser96 al ciclinei Bj sau Ser90 al ciclinei B2 de către cdc2 (fig. 5). în cazul maturării ovoci- telor de Xenopus activarea MPF este dependentă de defosforilarea Thy 15 și de ciclina B. Deosebirile care au fost sesizate în mecanismele de activare ale MPF la caras și la Xenopus nu se datorează doar ciclinei B și modalității în care ea evoluează în cursul creșterii și maturării ovocitului, ci și deosebirilor care există între activita- tea kinazelor și fosfatazelor care controlează starea cdc2 kinazei. La aceste aspecte se adaugă și faptul că ovocitele imature sunt blocate în momente diferite ale pri- mei profaze meiotice. La caras ovocitul este blocat într-un stadiu mai timpuriu al primei profaze meiotice, comparativ cu ovocitul de Xenopus. Vezicula germinativă a ovocitului de caras este plasată în centrul ovocitului și urmează să migreze spre polul animal în cursul maturării. în ovocitul de Xenopus se observă că vezicula germinativă este plasată ex- centric, la nivelul polului animal. EVENIMENTELE DIVIZIUNII CONTROLATE DE MPF MPF condiționează numeroase modificări în celulă pentru a declanșa faza M: cromozomii condensează, anvelopa nucleară trebuie distrusă, iar citoscheletul se reorganizează în vederea formării fusului de diviziune. MPF induce toate aceste evenimente esențiale prin intermediul activității sale proteinkinazice. Alte procese pot fi induse indirect, de exemplu prin fosforilări care activează alte proteinkinaze care acționează în cascadă pentru a altera starea celulei. Distrugerea nucleului necesită dezasamblarea laminei nucleare, formată din filamente laminale polimerizate. MPF catalizează în mod direct acest proces, forțând moleculele laminale să se dezasambleze prin fosforilarea lor la reziduurile de serină. Printre moleculele pe care MPF le poate fosforila direct, se numără și his- tona Hb care intervine în împachetarea cromatinei. MPF produce modificări la nivelul microtubulilor, fosforilând proteinele asociate acestora. în interfază cen- 188 ' Andrea Cristina Staicu et al. 10 11 Maturarea ovocitelor la Teleosteeni 189 trozomul concentrează microtubuli lungi care se întind pretutindeni în citoplasmă. Ulterior, acest aranjament dezasamblează și centrozomii concentrează un număr mai mare de microtubuli mai scurți, mai puțin stabili, care interacționează pentru a forma fusul de diviziune. Ambele componente ale MPF, ciclina și cdc2 kinaza sunt legate puternic de centrozomi, în celula vie. Se presupune că ciclina recunoaște componente ale centrozomului și mobilizează kinaza cdc2 la situs. Durata, viteza de sinteză și activarea complexelor cdc2/ciclină joacă un rol major în asamblarea corectă și localizarea fusului metafazei I și în pregătirea tranziției metafaza I/meta- faza II. Cu toate că nu se cunosc încă toate detaliile, MPF induce direct, sau indi- rect fosforilări ale multor proteine. Ulterior, pentru a ieși din diviziune celulele trebuie să revină la starea norma- lă. Mutații care inactivează proteinfosfataza I, una dintre fosfatazele celulare im- portante, vor împiedica sau vor întârzia puternic evenimentele ulterioare inactivării MPF, de exemplu reconstrucția anvelopei nucleare. FACTORUL CITOSTATIC (CSF), ELEMENT DE CONTROL AL CICLULUI CELULAR MEIOTIC Factorul citostatic realizează o activitate care apare în cursul maturării meio- tice, după distrugerea veziculei germinative. El răspunde de menținerea repausu- lui în metafaza II și a fost pentru prima oară descris de Masui-Markert în anul 1971. Toate observațiile experimentale, precum și modelele de reglaj celular au fost realizate până în prezent pe ovocite de Xenopus, dar cu siguranță, mecanisme- le moleculare sunt asemănătoare cu cele de la pești. CSF are multe trăsături comune cu MPF: sensibilitatea la Ca2+ (52), inacti- varea în momentul fertilizării, sensibilitatea la fosfataze (72), dar se deosebește de MPF prin faptul că activitatea sa devine aparentă doar după distrugerea veziculei germinative, în timp ce activitatea MPF este înregistrată anterior distrugerii vezi- culei germinative (49). Momentul apariției CSF sugerează posibilitatea ca el să fie activat de MPF. Natura CSF a fost lămurită în mod neașteptat prin studiul protooncogenei c-mos și este exprimată doar în celulele liniei germinale, neavând nici un rol în mitoză. ARNm al c-mos se acumulează în cursul ovogenezei, dar sinteza activă a proteinei c-mos se desfășoară doar când ovocitele sunt stimulate cu hormon induc- tor al maturării. Apoi ea este fosforilată în cursul maturării ovocitului, concentrația sa atingând un nivel maxim în perioada blocajului metafazei a Il-a. Sinteza de c-mos favorizează apariția MPF în cursul primei diviziuni meio- tice și dispariția spontană a acestuia, stabilizându-1, prin protejarea ciclinei, împo- triva degradării (72). C-mos este o proteină necesară și cetei de a doua diviziuni a meiozei, întrucât ovocitele lipsite de acest factor, dar care au suferit deja distrugerea veziculei ger- 190 Andrea Cristina Staicu et al. 12 13 Maturarea ovocitelor la Teleosteeni 191 minative și au un nivel scăzut de MPF, au fost incapabile să înceapă a doua diviziune meiotică. Ovocitele injectate cu c-mos și tratate cu cicloheximidă, nu ajung niciodată în meioza a doua, ceea ce sugerează că există cel puțin încă o proteină necesară pentru încheierea maturării meiotice. Ea ar trebui să acționeze împreună cu c-mos pentru a activa cdc2 kinaza, complexată cu ciclina B și să conducă la a doua ridica- re a nivelului MPF. Factorul citostatic care conține cel puțin o componentă c-mos, oprește ovoci- tele în a doua diviziune meiotică și împiedică distrugerea ciclinei, care se desfășoară, în mod obișnuit, ca o consecință a inactivării MPF. CSF este considerat un inhibi- tor al ciclului celular, care permite ciclului să progreseze până la a Il-a metafază meiotică și apoi determină un blocaj stabil până la primirea unui semnal, probabil un val de calciu, care însoțește pătrunderea spermatozoidului. C-mos are o activitate proteinkinazică prin care controlează starea de fosfori- lare a ciclinei și tubulinei (68), dar și a unei kinaze a MAPK (proteinkinază activa- tă mitogen), (MKK), pe care o fosforilează la reziduurile de serină și treonină (9, 27, 51). MKK activează MAP kinaza (MAPK), enzimă necesară formării fusului de diviziune, care trebuie fosforilată la reziduul de treonină și tirozină din subdo- meniul kinazic (7, 66). Toate cele trei semnale: mos, MAPK, MKK induc individual intrarea ovoci- telor în meioza I și își atenuează efectul în absența sintezei proteice. Există o buclă feed-back între MAPK și mos în cursul maturării meiotice, în care rolul MAPK ar fi ac^la de a favoriza sinteza și acumularea de mos, necesară încheierii meiozei și stabilizării MPF, prin inhibarea unui reglator negativ al MPF (69). Proteinkinaza A s-a dovedit a fi un antagonist al funcției mos, care inhibă translația mos, indusă de progesteron. Activarea cdc2-kinazei, mediată de mos, este necesară pentru a împiedica ovocitele, aflate în cursul maturării, să intre în faza S după prima diviziune meio- tică (20), în absența acestei proteine ADN se replică chiar după meioza I. Distru- gerea proteinei mos, în timpul metafazei I, provoacă reintrarea în interfază și face imposibilă trecerea de la metafaza I la metafaza a Il-a. S-a demonstrat că și alte protooncogene ras, tpr-met sintetizează proteine cu efect de inducere a maturării și efect citostatic (5, 14). •ASPECTE MORFOLOGICE ALE MATURĂRII OVOCITULUI LA TELEOSTEENI în ovocitul de pește, blocat în profaza I a meiozei, există un nucleu mare, sau veziculă germinativă cu cromozomi în „perie de lampă”, implicați în sinteza de ribonucleoproteine. Vezicula germinativă a ovocitelor este acoperită de ooplasmă opacă, plină de vitelus. După tratarea cu anumite lichide fixatoare, transparența vitelusului este crescută și vezicula germinativă poate fi văzută ca o structură brun-aurie, în lumină transmisă (25, 26). Ovocitele de caras iau o formă ușor aplatizată în timpul ultimului stadiu al vitelogenezei (55). Odată cu maturarea ovocitului, vezicula germinativă își modi- fică poziția: dacă inițial este plasată ușor excentric, ea urmează să se deplaseze spre polul animal, unde este localizat micropilul. Cu toate acestea durata și gradul în care se realizează trecerea în poziție periferică, variază între specii (26). După migrarea veziculei germinative la periferie, anvelopa nucleară se distruge, condu- când la amestecul componentelor nucleare cu ooplasma înconjurătoare. Se produc modificări citoplasmatice, cum ar fi fuziunea picăturilor lipidice de vitelus și a globulelor proteice de vitelus (79), fuziunea corpilor vitelini într-o masă centrală de vitelus fluidificat (80), proteoliza parțială a multor peptide viteli- ne (82, 81, 28, 9), pierderea incluziilor cristaline din corpii vitelini (71), creșterea rapidă a dimensiunii ovocitului cauzată de hidratare (31,79,80,13,29) și o creștere totală a transparenței (80, 26). în cursul maturării ovocitelor la Fundulus heteroclitus a fost semnalată pro- teoliza suplimentară a proteinelor viteline (81, 82). Ulterior, ea a fost descoperită la multe alte specii, în particular la peștii marini, care depun ponta pelagică (28). Procesul constă în clivajul lipovitelinului în peptide mai mici (81,28), care coinci- de cu pierderea capacității de fosforilare a fosvitinului (82, 28). De exemplu, la Verasper moseri s-a demonstrat că proteinele viteline sunt clivate de două ori: prima oară, în cursul înglobării vitelogeninului și a doua oară, în cursul maturării ovocitului. Lipovitelinul dimeric conținut în vitelogenin se trans- formă în monomeri atunci când se încorporează în ovule. De asemenea, fosvitinul teleosteenilor prezintă variații marcante ale masei moleculare. în cursul viteloge- nezei la Verasper moseri a fost identificată o proteină suplimentară, în afară de lipovitelin și fosvitin.Vitelogeninul acestei specii, care are o greutate moleculară de 520 kDa este descompus în lipovitelin de 410 kDa, componentul p de 19 kDa și fosvitin de 38 kDa, în cursul primului clivaj proteolitic al ovocitelor vitelogenetice. Modificarea discontinuă a greutății moleculare pare să reflecte schimbarea struc- turală a lipovitelinului de la forma dimerică, la cea monomerică în cursul matu- rării (fig. 6). Modelul electroforetic al lipovitelinului începe să se schimbe în stadiul III și se încheie în stadiul V. între proteoliza vitelusului și hidratarea ovocitelor pare să existe o relație strânsă. Aminoacizii liberi, al căror nivel crește în cursul maturării ovocitului datorită proteolizei, sunt probabil efectori osmotici, care determină influxul de apă în ovocite. Proteoliza vitelusului afectează și fertilitatea și supraviețuirea ovulelor, prin modificarea flotabilității acestora. Nu se cunosc enzimele care controlează cele două clivaje, dar cel de-al doilea clivaj nu implică mai mult de o enzimă și se consideră că este reglat direct sau indirect de steroidul care induce maturarea, pen- tru că se desfășoară în cursul scurtei perioade a maturării finale a ovocitului. Modificările ultrastructurale care au loc în citoplasmă ovocitului speciilor Oryzias latipes și Misgurnus anguillicaudatus, includ dispariția lamelelor inelate, 14 15 Maturarea ovocitelor la Teleosteeni 193 192 Andrea Cristina Staicu et al. SÂNGE >♦♦♦♦♦♦♦♦ >♦♦♦♦♦♦♦♦ « Vitelogenin 520 kDa ®(C\Componentul p 19 kDa Fig. 6 - Schema modelelor structurale ale vitelogeninului seric și proteinele viteline în ovocitele vitelogenetice și ovulele de Verasper moseri. alterări ale formei mitocondriei, care devine sferică (32, 33). în stadiile târzii ale maturării, ooplasma prezintă plachete lărgite de vitelus și reticul endoplasmatic tubular în toată ooplasma iar alveolele corticale sunt plasate sub zona pellucida. Aceste modificări ale componentelor ooplasmatice sugerează faptul că au loc anumite alterări moleculare și biofizice în timpul maturării. Microvilii, care în cursul ovogenezei stabilesc contactul ovocitului cu celu- lele granuloasei, în cursul maturării, se retrag din canalele corionului. în momen- tul ovulației se observă un strat cu o structură veziculară pe suprafața corionului, deși el nu este recunoscut în momentul ovulației (61). Celulele granuloasei formează în apropierea micropilului câteva straturi su- prapuse, în timp ce în alte regiuni, care înconjoară ovocitul, sunt aranjate într-un singur strat. în momentul distrugerii veziculei germinative, celulele granuloasei sunt în contact atât cu membrana bazală, cât și cu corionul. Suprafața adiacentă membranei bazale este relativ netedă, în timp ce partea opusă, partea corionică, prezintă mulți microvili. Aceștia invadează canalele porilor din corion și sunt în contact cu cei ai ovocitelor din canale. Nucleul celulei granuloase este localizat în centrul celulei sau spre ovocit. Regiunea dintre nucleu și membrana bazală conține mai ales mitocondrii, care dezvoltă creste (34). Un aspect caracteristic al celulelor granuloasei în această perioadă este existența mitocondriilor cu matrix electro- no-dens și creste bine dezvoltate (34), granule electrono-dense sau vezicule va- cuolizate (vezicule lizozomale), strâns asociate cu complexele Golgi. La câteva ore după distrugerea veziculei germinative, celula granuloasă își distruge legătura cu ovocitul, dar nu și cu membrana bazală. Microvilii lungi ai celulelor granuloase și ovocitului nu se mai inseră în lumenul canalelor porilor radiali ai corionului. O celulă foliculară se modifică dând naștere micropilului (67, 46, 77). La Oryzias latipes celula micropilară este identificată în stadiul V al dezvoltării ovocitului, în contact cu corionul care se formează, celula micropilară, deplin dezvoltată, pre- zintă în procesele citoplasmatice sinuoase, legături mari contorsionate ale micro- tubulilor, având în centru o legătură de tonofilamente. Corpul celular principal prezintă o mare masă de tonofilamente, mitocondrii, complexe Golgi și reticul endoplasmatic granular (60). Microtubulii și tonofilamentele funcționează, ca elemente principale ale ci- toscheletului, în menținerea formei celulare. De aceea, este posibil ca aceste ele- mente să joace un rol în diferențierea protuziei citoplasmatice, structură caracteristică celulei micropilare, care vine în contact cu oolema și conține câteva organite celulare. Legăturile tonofilamentelor sunt orientate de-a lungul axei lungi a protuziei citoplasmatice, care este răsucită în spirală. După distrugerea veziculei germinati- ve, în regiunea distală a protuziei citoplasmatice, microtubulii sunt dezorganizați, masa principală a mitocondriilor pare să fie translocată spre regiunea proximală a protuziei. Apoi aceasta începe să se retragă din canalul micropilar, pierzându-și legătura cu oolema. în momentul ovulației se constată o scădere a legăturilor tono- filamentelor în jurul nucleului celulei micropilare, urmată de scurtarea protruziei citoplasmatice. După retragerea completă a protuziei, celula micropilară devine ovală și cor- pul celular va'conține doar cantități mici de tonofilamente. Celulele micropilare se deosebesc de celulele granuloasei, cu care se înveci- nează, prin modul de distribuire al veziculelor lizozomale și al organitelor proemi- nente (de exemplu reticulul endoplasmatic granular din citoplasmă corticală, care se află în vecinătatea corionului). Elongarea canalului micropilar încetează în momentul finalizării formării stratului intern al corionului. în momentul distrugerii veziculei germinative celula micropilară, care con- tactează suprafața ovocitului, prin regiunea apicală a protruziei sale spiralate cito- plasmatice, este deplin dezvoltată. La câteva ore după distrugerea veziculei germinative, chiar înainte de ovulație, protuzia citoplasmatică se detașează de pe suprafața ovocitului și se retrage din canalul micropilar, prin scurtare. Nu se mai observă nici legături spiralate ale mi- crotubulilor, nici tonofilamente în protuzia citoplasmatică, care se scurtează, dar există o cantitate mică de tonofilamente în corpul celular principal. Din aceste observații se poate conchide că suplimentar pierderii comunicării joncționale dintre protuzie și ovocit, degradarea sau refacerea organitelor cito- scheletului, cum sunt microtubulii și tonofilamentele, determină contractarea protu- ziei citoplasmatice, urmată de retragerea canalului micropilar în momentul ovulației. 194 Andrea Cristina Staicu et al. 16 17 Maturarea ovocitelor la Teleosteeni 195 în cursul maturării ovocitului, nucleii celulelor granuloasei se mută de pe partea care se învecinează cu corionul spre partea opusă. în plus granulele dense strâns asociate cu complexele Golgi, dispar. în apropierea momentului ovulației, mulți microvili, atât ai celulelor granuloasei, cât și ai ovocitului, inserați în porii canalelor corionului, se retrag și protruzia citoplasmatică a celulei micropilare se detașează de pe suprafața ovocitului. Schimbări degenerative, cum ar fi creșterea numărului corpilor asemănători lizozomilor sunt sincron detectate în celulele gra- nuloasei în momentul ovulației (61). La peștii teleosteeni corionul sau zona radiata, care protejează vitelusul este foarte gros. Corionul ovulelor de Oryzias latipes, de exemplu, constă din două sau trei straturi: un strat exterior subțire, cu structură veziculară și lamele electro- no-dense, un strat intern gros (lamele electrono-dense cu interi amele mai puțin electrono-dense). Corionul ovulelor prezintă, de asemenea modificări progresive, cum ar fi întărirea și reducerea grosimii, scăderea solubilității proteinelor componente și creșterea durității. Aceste schimbări corespund ridicării și întăririi membranei viteline a ovule- lor ariciului de mare și ale amfibienilor. Modificările corionului depind de exo- citoza alveolelor corticale, care traversează toată citoplasmă corticală, începând din punctul în care penetrează spermatozoidul. Anumite substanțe din cortexul ovular participă la întărirea corionului, de exemplu ionii de calciu, substanța alve- olelor corticale, fosfolipidele, enzime, o proteină corionică, ce conține grupări SH și aldehide. CONCLUZII Factorii din mediul înconjurător acționează asupra unor structuri ale siste- mului nervos condiționând producția de GnRH. Gonadotropina este declanșatorul maturării meiotice, care acționează indi- rect, prin producția foliculară a unui hormon steroid inductor al maturării. Mecanis- mul molecular care mediază acțiunea gonadoțropinei implică proteine reglatoare G, adenilat ciclaza și AMPc. 17a, 20b-DP este cel mai activ hormon inductor al maturării, elaborat prin interacțiunea stratului tecal și granuloasei, care acționează la suprafața ovocitului. Etapa care succede acțiunii MIH, implică formarea unui factor citoplasma- tic, MPF, o serin/treonin kinază care controlează direct sau prin intermediul altor proteinkinaze, modificări importante în plan structural și biochimic. Blocajul ovocitului în metafaza a Il-a este controlat de un factor citoplasma- tic constituit din, cel puțin o componentă codificată de o protooncogenă. BIBLIOGRAFIE 1. AHN N. G„ SEGER R., KREBS E., Curr. Opin. Cell Biol., 4: 992-999, 1992. 2. AMANO M„ OKA Y., AIDA K., OKUMOTO N., KAWASHIMA S., HASEGAWA Y., J. Comp. NeuroL, 314: 587-597, 1991. 3. AMANO M., HYODO S., KITAMURA S., IKUTA K., SUZUKI Y., URANO A., AIDA K., Gen. Comp. Endocrinol., 99: 13-21, 1995. 4. AMANO M., HYODO S., KITAMURA S„ IKUTA K„ SUZUKI Y., URANO A., AIDA K., Gen. Comp. Endocrinol., 99: 22-27, 1995. 5. BIRCHCHMER C., BROEK D., WIGLER M„ Cell, 43: 615-621, 1985. 6. BRIZUELA L„ DRAETTA G., BEACH D„ Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 4362-4366,1989. 7. BOULTON T., NYE S„ ROBBINS D„ IP N„ RADZIEJEWSKA E., MORGENBESSER S„ De PINHO R., PANAYOTATOS N„ COBB M.; YANCOPOULOS G., Cell, 65: 663-675, 1991. 8. BRETONB., MOTINA., BILLARD R., KAHO., GEOFFRE S., PRECIGOUXG„ Gen. Comp. Endocrinol., 61: 109-119, 1986. 9. CARNEVALI O., MOSCONI G„ RONCARATI A., BELVEDERE P., ROMANO M., LIMA- TOLA E., Comp. Biochem. Physiol, 103A: 955-962, 1992. 10. CHANG J.P., JOBIN R.M., LEEUW R„ Gen. Comp. Endocrinol., 81: 447-463, 1991. 11. CHANG J.P., WONG A.O., VAN DER KRAAK G„ VAN GOOR F„ Gen. Comp. Endocrinol., 86:359-377,1992. 12. CONN P.M., HUCKLE W.R., ANDREWS W.V., McARDLE C.A., Recent Prog. Horm. Res., 43: 29-68, 1987. 13. CRAIK J.C.A., HARVEY S.M., J. Mar. Biol. Assoc. U.K., 67: 169-182, 1987. 14. DAAR I.O., WHITE G.A., SCHUH S.M., FERRIS D.K., Mol. Cell. Biol., 11: 5985-5991, 1984. 15. DEMSKI L.S., Am. Zool., 24: 809-830, 1984. ’ 16. DUNPHY W.G., BRIZUELA L„ BEACH D., NEWPORT J„ Cell, 58: 181-191, 1989. 17. FERRELL J.E., WU M„ GERHART J.C., MARTIN G.S., Mol. Cell. Biol., 11: 1965-1971,1991. 18. FESQUET D„ LABBE J.C., DERANCOURT J., CAPONY J.P., GALAS S„ GIRARD F„ LORCA T„ SHUTTLEWORTH L, DOREE M., CAV ADORE J.C., EMBO J., 12: 3111-3121, 1993. 19. FINET B., JALABERT B., GARG S.K., Gamete Res., 19: 241-252, 1988. 20. FURUNO N„ NISHIZAWA M„ OKAZAKI K., TANAKA H„ IWASHITA J., NAKAJO N„ OGAWA Y., SAGATA N., EMBO J., 13: 2399-2410, 1994. 21. GAUTIER L„ NORBURY S., LOHKA M„ NURSE P„ MALLERI, Cell, 54: 433-439, 1988. 22. GAUTIER L„ MINSHULL J., LOHKA M„ GLOTZER, HUNT T„ MALLER J.L., Cell, 60: 487-494, 1990. 23. GAUTIER I, MALLER J.L., EMBO I., 10: 177-182, 1991. 24. GE W„ CHANG J.P., PETER R.E., VAUGHAN J., VALE W„ Endocrinology, 131: 1922-1929, 1992. 25. GOETZF.W., BERGMAN H.L., Can. J. Zool., 56: 348-350, 1978. 26. GOETZF.W., Fish Physiology, W.S. Hoar, D.J. Randall, E.M. Donaldson, Eds, Academic Press, New York, voi. IX, 117-170, 1983. 27. GOMEZ N„ COHEN P„ Nature, 353: 170-173, 1991. 28. GREELEY M.S., CALDER D.R., TAYLOR M.H., HOLS H., WALLACE R.A., Gen. Comp. Endocrinol., 62: 281-286, 1986. 29. GREELEY M.S., HOLS HJr., WALLACE R.A., Comp. Biochem. Physiol., 100A: 639-647,1991. 196 Andrea Cristina Staicu et al. 18 19 Maturarea ovocitelor la Teleosteeni 197 30. GROBER M. S., BASS A.H., BURD G., MARCHATERRE M.A., SEGIL N., SCHOLZ K., HODGSON T., Brain Res., 436: 148-152, 1987. 31. HIROSE K., J. Fish. Res. Bd. Can., 33: 989-994, 1976. 32. IWAMATSU T„ OHTA T., NAKAYAMA N., SHOJIH., Annotnes Zool. Jap., 49: 28-37, 1976. 33. IWAMATSU T„ OHTA T., Develop. Growth. Diff., 19: 213-226, 1977. 34. IWAMATSU T„ OHA T„ Dev. Growth. Differ., 31: 45-53, 1989. 35. IZUMIT., WALKER D.H., MALLER J.L., Mol. Biol. Cell, 3: 927-939,1992. 36. JAFFEL.A., GALLO C. J.,Lee R.H., HO Y.-K., JONES, T.Z., J. Cell Biol., 121:775-783,1993. 37. JALABERT B., FINET B., Fish Physiol. Biochem., 2: 65-74, 1986. 38. JALABERT B„ FOSTIER A., BRETON B., WEIL C„ Vertebrate endocrinology. Fundamen- tate and biomedical implications, (P.K.T. Pang, M.P. Schreibman, Eds), Academic Press, New York, voi. IX, Part A, 23-90, 1991. 39. JESSUS C„ RIME H„ HACCARD O., VAN LINT I, GORIS J., MERLEVEDE W, OZON R„ Development, 111: 813-820, 1991. 40. KAGAWA H., YOUNG G., ADACHIS., NAGAHAMA Y., Salmonid reproduction (R.N. Iwa- moto, S. Sower, Eds), 20-25, Washington Sea Grant Program, University of Washington, Seattle, 1985. 41. KAH O., BRETONB„ DULKA J.G., NUNEZ-RODRIGUEZJ., PETER R.E., CORRIGAN A., RIVIER J.E., VALE W.W., Cell Tissue Res., 244: 327-337, 1986. 42. KAJIURA H„ YAMASHITA M„ KATSU Y., NAGAHAMA Y, Dev. Growth Differ., 35: 647-654, 1993. 43. KANAMORI A., ADACHI S„ NAGAHAMA Y., Gen. Comp. Endocrinol., 72: 13-24, 1988. 44. KATSU Y., YAMASHITA M„ KAJIURA H„ NAGAHAMA Y„ Dev. Biol., 160:99-107,1993. 45. KISHIMOTO T., Dev. Growth Differ., 30: 105-115, 1988. 46. LAALE H.W., Copeia, 210-225, 1980. 47. LABBE J.-C., PICARD A., PEAUCELLIER G„ CAV ADORE J.-C., NURSE P„ DOREE M„ Cell, 57: 253-263, 1989. 48: MALLER J. L, KOONZ J. W„ Dev. Biol., 85: 309-316, 1981. 49. MASUI Y„ MARKERT C.L., J. Exp. Zool., 177: 129-146, 1971. 50. MASUI Y., CLARKE H.J., Int. Rev. Cytol., 57: 185-282, 1979. 51. MATSUDA S., GOTOH Y., NISHIDA E„ J. Biol. Chem., 268: 3277-3281, 1993. 52. MEYERHOF P.G., MASUI Y., Dev. Biol., 7: 182-187, 1979. 53. MILLER K.E., KRIEBEL R.M., Gen. Comp. Endocrinol., 64; 396-400, 1986. 54. MUNZ H„ CLAAS B„ STUMPF W.E., JENNES L„ Cell Tissue Res., 222: 313-323, 1982. 55. NAGAHAMA Y„ Fish Physiology (W.S. Hoar, D.J. Randall, E.M. Donaldson, Eds), voi. IXA, 223-275, Academic Press, New York, 1983. 56. NAGAHAMA Y„ ADACHI S„ Dev. Biol., 109: 428-435, 1985. 57. NAGAHAMA Y., Dev. Growth. Differ., 29: 1-12, 1987. 58. NAGAHAMA Y„ Zool. Sci., 4: 209-222, 1987. 59. NAGAHAMA Y., Endocrine control of oocyte maturation. Hormones and reproduction infishes, amphibians and reptiles (D.O. Norris; R.E. Jones, Eds), 171-202, Plenum Press, New York, 1987. 60. NAKASHIMA S., IWAMATSU T., J. Morphol., 202: 339-349, 1989. 61. NAKASHIMA S., IWAMATSU T., J. Exp. Zool., 270: 547-556, 1994. 62. NAOR Z., Endocr. Rev., 11: 326-353, 1990. 63. NOZAKI M„ TSUKAHARA T.M., KOBAYASHI H., Endocrine correlates of reproduction (K. Ochiai, Y. Arai, T. Shioda, M. Takahashi, Eds), 3-27, Springer-Verlag, New York, 1984. 64. NOZAKI M., TSUKAHARA T., KOBAYASHI H., Biomed. Res., 4: 135-145, 1984. 65. POON R.Y., YAMASHITA K., ADAMCZEWSKI J.P., HUNT T„ SHUTTLEWORTH, EMBO1,12: 3123-3132, 1993. 66. POSADA J„ COOPER J.A., Science, 255: 212-215, 1992. 67. RIEHL R., Zool. Anz., Jena, 198: 313-327, 1977. 68. ROY L. M„ SINGH B„ GAUTIER I, ARLINGHAUS B, NORDEEN S.K., MALLER J.L., ' Cell, 61: 825-831, 1990. 69. SAGATA N., Bioessay, 19:(1) 13-21, 1997. 70. SCHREIBMAN M.P., MARGOLIS-KAZAN H„ HALPERN-SEBOLD L„ O’NEILL P.A., SIL- VERMAN R.C., Brain Res., 302: 180-183, 1984. 71. SELMAN K„ WALLACE R.A., SARKA A., QI X., J. Morphol., 218: 203-224, 1993. 72. SHIBUYA E.K., MASUI Y., Dev. Biol., 129: 253-264, 1988. 73. SOLOMON M.J., Mol. Biol. Cell, 3: 13-27, 1992. 74. SOLOMON M., Cell Biol., 5: 180-186, 1993. 75. STRAUSS J.M., MILLER W.L., Ovarian endocrinology (S. G. Hiller, Eds), 25-72, Blackwell Scientific, New York, 1991. 76. TADENUMA H., TAKAHASHI K., CHIBA K., HOSHI M„ KATADA T„ Biochem. Biophys. Res. Commun., 186: 114-121, 1992. 77. TAKANO K„ OHTA H., Bull. Fac. Fish., Hokkaido Univ., 33: 65-78, 1982. 78. VAN DER KRAAK G.J., JACOBSON P.M., Proceedings of the Fourth International Sympo- sium on Reproductive Physiology of Fish (A.P. Scott, J.P. Sumpter, D.E. Kime, M.S. Rolfe, Eds), Fish Symp., Sheffield, 91: 215-217. 79. WALLACE R.A., SELMAN K„ Dev. Biol., 62: 354-369, 1978. 80. WALLACE R.A., SELMAN K„ Am. Zool., 21: 325-343, 1981. 81. WALLACE R.A., SELMAN K„ Dev. Biol., 110: 492-498, 1985. 82. WALLACE R.A., BERGOVAC P.C., J. Biol. Chem., 260: 11268-11274, 1985. 83. WASSERMAN W.J., SMITH L.D., The vertebrate ovary, (R.E. Jones Ed), Plenum Press, New York, 443-468, 1978. 84. YAMASHITA M„ FUKADA S„ YOHIKUNI M., BULET P., HIRAI T„ YAMAGUCHI A., LOU Y.-H., ZHAO Z„ NAGAHAMA Y., Dev. Biol., 149: 8-15, 1992. 85. YAMASHITA M., FUKADA S., YOSHIKUNI M., BULET P., HIRAI T„ YAMAGUKI A., YASUDA H., OHBA Y„ NAGAHAMA Y„ Eur. J. Biochem. 205: 537-543, 1992. 86. YAMASHITA M„ KAJIURA H„ TANAKA T„ ONOE S„ NAGAHAMA Y„ Dev. Biol., 168: 62-75, 1995. 87. YAN L„ SWANSON P„ DICKHOFF V'.W., Biol. Reprod., 47: 418-127, 1992. 88. YOSHIKUNI M„ NAGAHAMA Y., Dev. Biol., 166: 615-622, 1994. 89. YOUNG G„ KAGAWA H„ NAGAHAMA Y., Biol. Reprod., 29: 310-315, 1983. 90. YOUNG G., ADACHI S., NAGAHAMA Y„ Dev. Biol., 118: 1-8, 1986. Primit în redacția Facultatea de Biologie, la 22 mai 1997. Splaiul Independenței, nr. 296, București.